Okunma: 7497 kez

Temel mantığı, hazırlanan çözeltiden belirli spektrumlarda ışık geçirilmesi ve bu ışının ne kadarının çözelti tarafından absorblandığını bulması esasına dayanır. Çözeltinin içerdiği madde miktarı ne kadar fazla ise daha fazla ışın, çözelti tarafından soğurulur. Spektrofotometre, çözeltinin içinden geçebilen -çözelti tarafından absorblanmayan- ışığın yoğunluğu tespit ederek çözelti içeriğindeki aranan maddenin miktarı hakkında kantitatif bilgi verir. Örneğin, farklı sıcaklıklarda bakterilerin gelişiminin gösterilmesi için; çeşitli ortamlara bırakılan bakteriler daha sonra çözeltiler içinde teker teker spektrofotometre ile ölçüldüğünde bakterilerin fazla olduğu örnekte daha fazla absorblanma gözlenecektir. Dolayısıyla bu da bize ortamdaki sıcaklığa bağlı bakteri büyüme hızı ile ilgili bilgi verir. Sonuçta, daha fazla bakteri daha fazla madde demektir ve bu da absorbsiyonun daha fazla olması anlamına gelir.

Spektrofotometre’in içerdiği başlıca iki yapısı vardır. Bunlardan birisi ışık kaynağı olan spektrometre ve fotometre olarak adlandırılan ışık detektörüdür (Diyagram 1).

İncelenecek örnek spektrometre ile fotometre arasına ve küvet olarak adlandırılan, genellikle sert plastikten ya da quartz’dan yapılan özel tüp içine yerleştirilir.  Farklı örnekler farklı dalga boylarını absorbladıkları için öncelikle bu aralığın bulunması gerekir. Örneğin DNA’nın bilinen spektrum aralığı 260 nm’dir. DNA miktarı incelenirken bu aralık kullanılır. Bu aralığın bulunması için  spektrometre ile tüm aralıklarda örneğe ışın gönderilir. Elde edilen sonuçlardan elde edilen grafik incelendiğinde incelenen maddenin hangi aralıkta ışığı absorblandığı  anlaşılabilir (Grafik 1).

 

Bu absorbsiyon aralığı bulunduktan sonra spektrometre ile bu aralıkta örneğe monokromatik -belirli bir dalga boyuna ait-  bir ışın gönderilir. Spektrofotometreler gönderdiği ışığın dalga boyuna göre çeşitlidir.  Gönderilen ışık, küvet’in içindeki örnekten geçtikten sonra fotometreye ulaşır. Spektrometre’den gönderilen ışık ile fotometreye ulaşan ışık arasındaki fark bize absorblanma miktarını verir. Absorblanma terimi absorbans’tır ve Beer-Lambert teoreminden hesaplanır. (Formül 1)

Formülde, A absorbansı, I0  Spektrometre’den gönderilen ışığın yoğunluğunu, I1 ise küvetten geçtikten sonraki ışığın yoğunluğunu temsil eder (Diyagram 2).

Spektrofotometre ile yapılan ölçümler sonucunda derişim-absorbans grafiği çizilebilir (grafik 2). Burada dikkat edilmesi gereken husus derişim-absorbans fonksiyonunun belirli bir değere kadar lineer daha sonra da negatif artış göstererek sabit bir değere yaklaşmasıdır. Bunun sebebi çözeltideki  madde miktarının belirli bir seviyeden sonra ışığın geçeceği aralıkların moleküller tarafından dolması, dolayısıyla da maddenin tüm ışığı absorblamasıdır.

Grafik 2: Örnek bir derişim-absorbans grafiği. Absorbans değerinin bir süre sonra sabit bir değere yaklaştığı görülebilir.

Ölçümün yapılması için öncelikle referans –blank- olarak, içinde incelenecek maddenin olmadığı bir çözelti hazırlanması gerekir. Standart bir referans çözelti, su, indikatör ve varsa tampon çözelti içermelidir. Referans çözeltilerin amacı spektrofotometrenin ölçüm değerinin daha hassas olmasını sağlamaktır. Referans çözeltiler ile ölçüm yapıldığında spektrofotometrenin ölçeği sıfırlanır. (diğer bir deyişle yapılan ölçümün absorbansının 0 -%100 geçiş- olduğu belirtilir.) Örnek çözelti ile referans çözelti arasındaki absorbans farkı az olduğundan spektrofotometre daha kesin sonuçlar verecektir. Referans çözeltinin yerine saf su konulması bu farkı çok açacağından daha az hassas sonuçlar verir. Dolayısıyla spektrofotometre. analizlerinde referans olarak saf su kullanılmaz.  Referans çözelti, farklı spektrofotometre çeşitlerinde farklı olarak kullanılsa da işlevi aynıdır.

Spektrometre ile protein ölçümü yapılabilmesi için de örneklerin önce belirli belirteçler ile renklendirilmesi gerekir. Örneğin Bradford belirtecini örnek alalım. Bradford çözeltisi protein belirtecidir ve standart olarak BSA (bovine serum albumin) işaretlemede kullanılır. İşaretlendiğinde oluşan kompleks 595 nm dalga boyunda ışığı absorblar. Bu dalga boyunda ölçümler yapılır.

Etiketler:  

Bilimler
Biyoloji
Spektrofotometre

Sadece kayıtlı kullanıcılar yorum yazabilirler.
Lütfen hesabınıza giriş yapınız veya kayıt olunuz.

---