Mikrobiyoloji

Ara 04 2007

Mikrobiyoloji

(0 Oy)

GenBilim Editor
Salı, 04 Aralık 2007
Okunma: 2145 kez Kemoterapi: Herhangi kimyasal bileşiğin bir hastalığın iyileştirilmesi veya bir enfeksiyonun yok edilmesi için sistemik olarak vücuda verilmesine kimyasal bileşiklerle tedavi anlamına gelen kemoterapi adı verilir. Bir kimyasal bileşiğim bu amaçla kullanılabilmesi için selektif toksisite adı verilen özel bir davranış göstermesi gerekir. Yani hasta organıizmanın hücrelerine hiç zarar vermeden (veya tahammül edilebilir düzeyde zarar verir) yok edilmek istenen enfeksiyon etkenine üremeyi durdurmak veya yaşamını devam ettirememe düzeyinde etki etmelidir. Sonuç olarak insan veya hayvan vücudundaki parazit yok edilir ve enfeksiyon ortadan kaldırılmış olur. Selektif toksisitenin ilk tarifi Paul EHRLİCH tarafından yapılmıştır. Buna göre kullanılan kimyasal madde parazit canlıya mümkün olan en üst düzeyde zarar verirken konak canlıya ve onun hücrelerine mümkünse hiç zarar vermemelidir. Böylece enfeksiyon hastalıkları tedavi edilebilir. Paul EHRLİCH bu gözlemini beygir frengisi etkeni olan trypanosama equiperdum isimli parazitin Trypon kırmızısı boyasından etkilenmesini incelerken fark etmiş ve bu tanımı yapmıştır. Beygir hücrelerinin bu boyayı sitoplazmalarına almalarına rağmen trypozomun bu boyanın sitoplazmasına geçişini engelleyemediğini ve vücuduna dolan bu boya yüzünden öldüğünü fark etmiştir. 1935 yılında Sülfanamide keşfedilmiş ve çok kısa bir süre içerisinde enfeksiyon hastalıklarına kemoterapi uygulaması bir patlama yapmıştır. 1912 ‘de Flemming penisilin etkisini gördüğü halde bu ilaç ilk defa 1940’ta tedavi amacıyla kullanılmaya başlanmıştır. Bir kaç yıl içinde bakterilerden, actinomisedlerden ve mantarlardan elde edilen ve antibiyotica adıyla anılan yüzlerce bileşik keşfedilmiştir. Antibiyotik bir canlının sentezlediği ortamda bulunan veya bulunabilecek olan diğer organizmaların çoğalmalarını engellemek üzere ortama verilen biyolojik bileşiklerdir. Günümüzde yarı sentetik veya tam sentetik antibiyotiklerde kullanılmaktadır. Antibiyotiklerin herhangi bir zaman diliminde etkilendiği organizmaların çoğu zamanla bu bileşiklerden etkilenmemeye başlarlar. Buna antibiyotik dirençliliği adı verilir. Kemoterapide kullanılan antibiyotik bileşiklerinin etki mekanizmaları aşağıdaki gruplardan birine uyar. 1) Önemli bileşiklerle kimyasal benzeri (analog) üremeyi durdurmak ; örnek sülfanamidler. Canlılarda her enzim kendisi için özel bir substratlarla ilişki kurarak bir reaksiyonu kataliz eder. Reaksiyon sona erdiğinde meydana gelen üründen ayrılarak yeni bir substrat molekülü bağlanmaya hazır hale gelebilir. Herhangi bir kimyasal madde kimyasal striktür olarak bir enzimin substaratına çok benzerse enzim buna bağlandığı zaman reaksiyonu gerçekleştiremediği gibi onun kendi aktif merkezinden uzaklaşmasını da sağlayamayınca saf dışı kalmış olur. Enzimleri tükenen canlı üreyemez veya yaşamını devam ettiremez. Sülfanamidler kimyasal benzerlikleri sebebiyle bir çok maddenin folik asit sentezleme aşamalarında önemli bir metabolit olan p.amino-benzoik-asit(PABA) yerine buna özel enzimi bağlanır ve enzimi saf dışı bırakırlar. Enzimden ayrılsalar bile hücrenin içi o enzimleri sürekli meşgul eden bir yığın yabancı bileşikle dolar.( yanlış kurulmuş folik asitler). Hayvansal hücreler folik asit sentezlemezler. Folik asidi dışarıdan hazır olarak aldıkları için sülfanamidlerin onlara zarar vermeleri söz konusu değildir. (Selektif toksisite tamdır ). Sülfanamidlerin etkileri bakteriostatiktir. Besiyerine bol miktarda (PABA) ilave edilirse bakteriler tekrar üremeye başlayabilirler. Tüberkiloz sülfanamidlerden hiç etkilenmezler. Buna karşılık p.amino-salisilikasit bunları yüksek düzeyde inhibe ederler. Yapılan araştırmalarda pas’tan etkilenlerin sülfanamidlere, sülfanamidlerden etkilenlerin ise pasa dirençli olduğu görülmüştür. Demek ki mikro organizmaların pürin bazı sentezleme yolunda oluşturmak zorunda oldukları folik asitdin sentezi sırasında ya PABA için farklı konfigürasyon gösteren yada tamamen farklı enzimler kullanılmaktadırlar. Böylece sülfanamidin uyum gösterdiği bölgeye pas girememektedir. Trimetokrin, protozoaların ve bakterilerin di-hydrofolikasit redüktase enzimlerini etkileyerek bunlar üzerine son derece yüksek inhibasyon etkisi yapar. Memeli hayvanlarda bu işle görevli enzim trimetokrinden hemen hemen hiç etkilenmez. Sülfanamidlerle, trimetokrinin parazit protozonlarla bir çok bakteride folik asit sentezi yolu üzerinde ard arda yerleşik iki farklı reaksiyonu bloke ettikleri bulunmuştur. Birlikte kullanılırlarsa bağırsak enfeksiyonlarında, idrar yolları enfeksiyonlarında ve sıtmada çok başarılı sonuç verirler. 2) bakteri duvar sentezinin bloke edilmesi: Penicline’ler ve cephalosporineler. Bakteri vucudunu korse gibi sararak osmotik basınç dengesizliklerine karşı lizi olmaktan koruyan bakteri duvarı memeli hayvan hücrelerinde bulunmayan bir yapıdır. Gr (+) bakterilerinin sitoplazmik osmotik basınçlarının, Gr(-) bakterilerinkinden 3-5 kat fazla olduğu bulunmuştur. Bakteri duvarının sağlamlığı peptidoglikan veya murein adı verilen özel bir molekülden kaynaklanır. (örgülü dev bir çatkı ).Penisilin ve sefarosilinler murein sentezi sırasında iskeleti oluşturan yan bağları yapacak olan tetrapeptit zincirlerinin bağlantı kurmasını engellerler. İskeletin uzamına ipliklerini oluşturan N-asetilglikozamin ve N-asetilmuramikasit oluşumu bu antibiyotikler tarafından herhangi bir etki görmez. N-asetilmuramikasit moleküllerinin komşu iplikler arasında birbirine bağlanmasını sağlayan tetrapeptit yan zincirler başlangıçta pentapeptit zincirler şeklinde sentezlenirler. Bu zincir diğer ucuyla komşu ipliğin N-Asetilmuramikasit molekülleri bağlanırken zincirin en sonundaki D-Alanin kopmak zorundadır. Buna transpeptidasyon reaksiyonu denir. Reaksiyonu gerçekleştiren enzim transpeptidazdır. Penisilin ve sefarosilinler, Acyl-D-Alany-D-Alanin bileşiğine çok benzemeleri sebebiyle transpeptidaz enzimini aldatırlar ve saf dışı bırakırlar. Murein çatkısı kurulamadığından hücre patlar. Görüldüğü gibi bu iki antibiyotikte sadece yani murein bileşiklerini sentezlenirken etki gösterebildiklerinden bölünmeyen bakteri hücrelerine zarar veremezler. Her iki antibiyotikte önce staphlococlarda keşfedilmiş ancak daha sonralarıda birçok Gr(-) bakterilerde üretildiği fark edilmiş ve B-Lactamase kolayca parçalanır ve imha edilirler. Zamanla B-Lactamase moleküllerine yapışmayı çok seven penisilinler bulunmuştur. B-lactamase bunları parçalayamaz veya bunları çok uğraşarak parçalayabilirler. Kombine tedavi adi verilebilen farklı antibiyotiklerin birlikte kulanılmaları şeker uygulamalarda claxaciline birlikte transpeptidaz enzimle üzerine çok etkililer. Ancak B-Lactamase büyük zarar görebilen ampiciline birlikte verilebilirler. Peniciline veya calaxaciline ortamdaki veya hücredeki B-Lactamase enzimi molekülleri kuşatıp meşgul ederken ampiciline bu fırsattan yaralanıp murein sentezini bloke eder. Bacitracin, Novobiocin, ve Venacomycine bir çok antibiyotik murein sentezinin membranda üretebilen ilk aşama bileşiklerinin oluşmasını engelleyerek etkili olurlar.(erken protein sentezi ) 3) Membran fonksiyonlarını bozarak etki ederler.Herhangi bir hücrenin plazma membranı onun dış dünyayla ilişkisini kontrol eden en önemli yapılardan biridir. Herhangi bir hasar sebebiyle selektif permabilitesi bozulacak olursa hücre çok değerli bileşiklerini pürin ve primidin bazları içinde tutamaz ve yaşamını yitirir. Polymyxine, polyen antibiyotikler, bakteri ve mantar membranlarının yapılarına selektif müdahale ederek bunların fonksiyonlarını bozarlar, bakteri ve mantarların çoğalmasını inhibe ederler. Bu iki antibiyotikten biri diğerinin etki ettiği __________________ phosphatidyle thonolamin sadece bakteri membranlarına özgü bir bileşik olan fosfotidil etanolamin ile raksiyona girerek bakteri membranını harap ederler. Ökaryotlarda bu bileşik bulunmadığından polymixine bunlara zarar veremez. Mantarlarda ökaryottur. Polyen antibiyotikler yapısında sterol bulunan membranlara bağlanırlar. Bunların fonksiyonlarını bozarlar mantar membranlarında bol miktarda sterol vardır. Fakat bakteri membranlarında hiç sterol bulunmaz dolayısı ile polyen antibiyotikler ancak sıkı hastane koruması altında uygulanabilirler. 4)Chloromphenicol,Tetracycline,Macrolida antibiyotikler ve Aminoglycosida antibiyotikler memeli hayvan hüc. Bakteri hücreleri arasındaki sitolojik yapı farklılıklarına dayanarak etki ederler. Selektif toksisiteleri ökaryot ribozomu ile prokaryot ribozomu moleküler düzeydeki yapısal farklılıklarına dayanır. Memeli hayvan hücresinin ribozonları 70s liktir ve her iki grubunda taşıdıkları protein alt birimler birbirinden farklıdır. Chloromphenicol bakteri ribozomunun 50s lik alt birimine bağlanır. Sentezlenmekte olan proteinin uzamakta olan a.a bağlanmasını engeller. Etkisinin peptidil transferaz enzimini bloke etmesinden kaynaklandığı sanılmaktadır. Bakteriostatik etkilidir. Ortamdan kaybolduğu zaman bakteriler tekrar üremeye başlarlar. Chloromphenicole dirençli olan bakteriler chloromphenicolasetiltransferaz adı verilen bir enzim üretirler. Chloromphenicol ü parçalayıp etkisiz hale getiritler. Bu yetenek bazı bakterilerde plazmid adı verilen ekstrakromozomal genetik elamanlar üzerindedir ve konjugasyon yoluyla bakteriden bakteriye yayılabilir. Tetracycline’ler 30s lik alt birime bağlanarak bakteri ribozomuna aminoasit taşıyan tRNA nın sokulmasını ve 30s lik alt birimle ilişki kurmasını engellerler. Tetracycline lerin plazma membranından bol miktarda geçmesi bakterinin hassasiyetini ifade ederken bu antibiyotiği sitoplazmasında biriktirme yani onu plazma membranından içeri sokmayan bakteriler tetracycline dirençlidir. Bu özellik kromozom kökenli olabildiği gibi bazen plazmid üzerinde bulunur ve diğer bakterilere geçebilir. Makrolida antibiyotikler Erhtromicine ve Oleandomycine dir. Bakteri rübozomunun 50s lik alt birimine bağlanır. Buraya aa. Yaklaşmasını ve bağlanmasını engellerler. Büyük bir olasılıkla translokasyon ________________________. Makrolitlere direnç 50s lik alt birime bu antibiyotiklerin bağlanması için gerekli olan proteinin değişmesine ve kaybolmasına bağlıdır. Antibiyotik bağlanacak yer bulamayınca etkide göstermez. Ayrı bir gruba giren Lincomycine antibiyotiği 50s lik alt birime bağlanarak makrolit antibiyotiklerinin etkisine benzer bir davranış gösterirse de daha erken protein biyosentez aşamalarını ve özellikle initasyon(başlangıç) aşamasını bloke ettiği kabul edilir. Dirençlilik bağladığı proteinin modifikasyonundan kaynaklanmaktadır. İsimleri birbirinden farklı olsada etki mekanizmaları tamamen aynı olan Konomycine, Gentomycine, Streptomycine, Tobramycine, Neomycine gibi antibiyotikler bakteri ribozomunun 30s lik alt birimine bağlanır ve burada okunmakta olan mRNA daki şifrenin yanlış tercüme edilmesine sebep olurlar. Gerekli a.a yerine yanlış bir a.a taşıyan enzimler hatalı çalışırlar veya iş göremezler. Tetracycline’ler ve makrolida antibiyotikler gibi bunlarda bakteriostatik etki yaparlar ve ortamdan uzaklaştırılırlarsa bakteriler tekrar üremeye başlarlar. Bazı bakteriler bunları parçalayan veya modifize eden enzimler salgıladıklarından dirençli olurlar genellikle kromozomal kökenli bir dirençlilik şeklinde ortaya çıkar. Diğer bir fenomen ise bunların 30s lik alt birimine bağlanacakları proteinin modifize olmuş olmasıdır. Genellikle kullnılan antbiyotik dozuna bağlı olmadan bir seferde ve tam dirençlilik şeklinde gelişen bu dirençliliğe tek adım dirençliliği veya streptomycine dirençliliği tipi adı verilir. Neisseria Meningitidis’in bazı mutant suşları gerekli enzimlerinin hatalı a.a taşıması sebebiyle düşük sayıda üreyebildiklerinden bulundukları boğaz floralarında sorun yaratmazlar. Bunların bulunduğu ortamlara ve insanlara streptomycine verildiğinde normalde hatalı olarak okunan aminoasitlerin tekrar hatalı okunması sonucu doğru a.a zincirine sokulursa bu bakteriler hızla üreme yeteneği kazanırlar ve tehlikeli enfeksiyon yaratabilirler. 5) Nükleik asit sentezinin bloke edilmesi:Actinomycine DNA sentezini ve dolayısıyla DNA ile ilgili her türlü reaksiyonu kuvvetle bloke eden antibiyotiklerdir. DNA’nın dezoksiguanozin redikallerine kuvvetle bağlanarak DNA molekülünü tamamen kuşatır. İki iplik hiçbir şekilde gereken yerlerden ne replikasyon nede transkripsiyon için ayrılmadığından her şey durur.Mitomycine DNA’yı ilmek ilmek depolimerize eden çok etkili bir antibiyotiktir. Ancak her ikiside gerek bakteri gerek virüs gerekse memeli hayvan DNA’ları arasında fark gözetmeden etkili olduklarından sadece araştırma amaçlı kullanılabilirler. Asla ilaç olarak kullanılmazlar. Antibiyotik(Antimikrobik Madde) Dirençliliğinin Gelişme Şekli 1)Mikroplar antibiyotiği daha vücüt dışında iken parçalayarak etkisiz hale getirirler. Genellikle peniciline dirençliliği şeklinde tanımlanan bu dirençlilik tipi özellikle Gr(-) bakterilerde çok adımlı (doz arttıkça artan dirençlilik) dirençlilik tipi şeklinde karşımıza çıkabilir. Chloromphenicol’e karşı aynı mekanizma ile dirençlilik görülür. Aminoglikozit antibiyotiklere karşı görülen modifize edici enzimlerden kaynaklanan dirençlilikte bu gruba girmektedir. 2)Mikroorganizmalar ortamdaki antibiyotiklere karşı permeabilite bariyerleri kurup onu vucutlarına almayabilirler. Tetracycline dirençliliği bu yöndeki en güzel örnektir. Bunun yanı sıra polimixinlere olan dirençlilikte buna benzer. 3)Mikroplar genellikle bir mutasyon sonucu kalıcı bir değişiklik ve antibiyotiğin etkili olabilmesi bağlanması gereken noktada ki yapıyı değiştirir veya yok ederler. Bu durumda tek adımlı streptomycine tipi dirençlilik ortaya çıkar. Macrolida antibiyotikler 50s lik alt birime, aminoglikozid antibiyotikler 30s lik alt birimde antibiyotiğin bağlanacağı proteinin değişmiş olması sebebiyle etkisiz hale gelirler. 4)Bakteriler normalde takip ettikleri biyosentez yolunu değiştirebilirler veya bundan vazgeçerler. Antimikrobik bileşiğin bloke ettiği biyosentez davranışı değişince rekabet edilecek bileşik kalmaz ve dirençlilik ortaya çıkar. Sülfanamid’e dirençli olan bakteriler çoğu kez folik asit sentezleme davranışlarını değiştirirler tıpkı memeli hayvan hücreleri gibi madur veya yarı madurfolik asit derivatları(öncü bileşik) dışarıdan hazır olarak alırlar. PABA’ya ihtiyaç kalmadığından sülfanamidin rekabet ortamı yok edilmiş alabilir. 5)Mikroplar gerçek substratını çok daha iyi tanıyan enzimler sentezlemeye başlarlar. Bu durumda antabolist davranmak isteyen bileşikler daha iyi tanındıkları için enzimleri aldatamazlar. Bazı sülfanamid dirençli bakterilerde ki enzimleri doğal substratları olan PABA’yı sülfanamidlere göre 400 kat daha iyi tanıdıkları bulunmuştur. Mikroorganizmalarda görülen dirençliliğin orjini iki farklı şekilde karşımıza çıkar. Bunlardan biri daha çok o anlık modifikasyon şeklinde açıklayabileceğimiz çevresel faktörlerden kaynaklanan dirençlilik halidir. Penisilinlerin etkili olabilmeleri için bakterilerin mutlaka çoğalma eğiliminde olması lazımdır. Üremeyen bakteriler bu antibiyotikten etkilenmezler. Vücudun çevresel osmotik basıncı izotoniğe yakın bölgelerinde penisilin veya sefalaspolin etkisiyle duvarlarını kaybetmiş(L-Formuna dönüşmüş) bakteriler ortam koşulları bozulmadıkça duvarsız olarak çoğalmaya devam ederler. Bunların tedaviden etkilenmemesi ve varlıklarını sürdürememesi fenomenine persiste etmek denir. Çevresel faktörlerden kaynaklanmayan yada doğal yada sonradan oluşmuş bazı genetik özellikler sebebiyle dirençli hale gelmiş mikroorganizmalarda bu davranış kromozomal kökenli olabilir. Özellikle gr(-) bakterilerin dirençlilik plazmidleri tehlikeli tablolar oluşturur. 1976 yılında Japonya’da chloromphenicol’e tetracycline ,stroptomycine ve amplicyline dirençlilik geni taşıyan plazmidlere sahip Shigella bakterileri ortaya çıkmıştır. Bunların konjugasyon yoluyla bu plazmidleri E.coli bakterilerine aktardıkları bulunmuştur. Çapraz Direnç Birbirine kimyasal akraba olan antibiyotikler arasında bunlardan birine dirençlilik söz konusu ise aynı organizmanın diğerlerine de dirençli olduğu çok yüksek bir olasılıktır. Örneğin Neomycine/Konamycine, Erhthromycine/Oleandomycine ve Polymyxine-B/Colistin dirençlilikleri böyledir. Ender olarak Eritromisin/Lycomycine kimyasal olmadıkları halde çapraz direnç gelişmesi görülebilir. Çapraz direncin gelişmesini önlemek için: a)Tedaviye yeterli yüksek dozda başlamalı ve bir jenarasyondaki mikropların mümkün olan en büyük kısmını yok etmelidir. b)Genel anlamda dirençlilik gelişimini engellemek amacıyla farklı noktalarda ve birbirini destekleyecek şekilde etkili olan en az iki antibiyotiğin veya iki antimikrobik bileşiğin birlikte uygulanması mesela tüberküloz tedavisinde Ethambutol+isoniasid birlikte verilirse tedavi çok başarılı olur. c)Antibiyotikleri antibiyogram yapmadan kullandırmamak gereklidir. Bu taktirde düşük dozda kısa sürede yeterli tedavi sağlanır. İmmünoloji-Seroloji Memeli hayvan ve insanların vücutlarına genellikle protein karakterli virüsler dahil olmak kaydıyla çeşitli mikroorganizmaların ve ayrıca ister makroskobik ister mikroskobik parazitler ilk kez girdiklerinde kendilerine karşı özel bileşiklerin sentezlenmesine yol açıyorlarsa bunlara çok genel anlamda antijen adı verilir. Aslında antijenlere karşı insan ve memeli hayvan vücutlarında sentezlenen özel bileşiklerin genel adı ise antikordur. Genellikle vücuda ilk kez giren antijene karşı 8-10 gün sonra serumda saklanabilecek düzeyde antikor üretilir. Böylece örneğin enfeksiyon etkenine karşı bir savunma davranışı uygulanır. Bir enfeksiyon hastalığında vücudun ortaya koyduğu bu savunma mekanizmasını geniş kapsamlı sonucu o enfeksiyona karşı bağışıklık şeklinde karşımıza çıkar. Bağışıklığın oluşmasıyla ilgili araştırmalar yapan bilim dalı immünolojidir. Bağışıklık reaksiyonları sırasında ortaya çıkan antikor dahil her türlü özel bileşiğin in-vitro koşullarda saptanmasında bazen de in-vivo olarak bazı reaksiyonların incelenmesine ait tekniklerle uğraşan bilim dalı ise seroloji olarak tanımlanır. Serolojik reaksiyonlar araştırılan özel bileşiklerin ve yapıların karakterine bağlı olarak bazen deney tüpünde bazen jel ortamında zaman zamanda florasan mikroskobuyla gözlenebilecek ortamlarda yapılır. Prensip olarak hastanın serumunda söz konusu olabilecek patojen mikroorganizmaya karşı antikorların bulunup bulunmadığı varsa ne kadar antikor bulunduğu araştırılır. Bazı antikorlar enfeksiyonun ilk devresinde ortaya çıkar fakat kısa bir süre sonra serumdan kaybolabilirler. Bazı antikorlar ise oldukça geç ortaya çıkarlar ama yıllarca serumdan yüksek seviyede varlıklarını sürdürebilirler. aglütinasyon Reaksiyonları: Bu reaksiyonun ismi aglütinojendir. Bu hücreler veya partiküller üzerinde bulıunur. Serumda bunlara karşı bulunan homolog antikorların ismi aglütinindir. Partiküller veya hücrenin üstünde ki aglütinojenler serumda ki homolog aglütininleri ile karşılaştıkları zaman hücreler veya partiküller irili ufaklı kümleler oluşturarak çökerler. Bu olaya aglütinasyon denir. Aglütinasyon reaksiyonlarında bakteri süspansiyonları kullanılmaktadır.(antijen olarak). Süspansiyondaki bakterilerin hiçbir sebep yokken kendiliğinden birbirlerine yapışması yalancı pozitif sonuçlar doğuracağından bu problemi ortadan kaldırmak için aglütinasyonda kullanılacak bakteri süspansiyonları fizyolojik tuzlu su ile hazırlanır. Aglütinasyon testlerinin uygulamasında genellikle 37 C bazende 50-55 C gibi sıcaklıklar tercih edilir. 36-37 C memeli hayvan vücut sıcaklığını yansıttığından daha güvenilir sonuçlarda alınır. Serum elde etmek için genellikle kol bileğinden 5 ml kan almak yeterlidir. Kan steril bir tüpe boşaltıldıktan sonra eğik olarak pıhtılaşması sağlanır daha sonra pıhtı steril bir cam bagetle kenardan ayrılır ve serum dikkatle toplanır. Alınan serumu steril bir şişeye aktarıp gerekirse eritrositlerden kurtarmak üzere santrifüj etmek uygundur. Antijenlerin Hazırlanması: ağırlıklı olarak rutin çalışmalarda karşılaşacağımız organizmalar bakteriler olduğundan bakterilerden antijen hazırlamak için aşağıdaki metodlar kullanılır. Bakteri antijenleri esas olarak 2 tanedir. H antijeni adı verilen antijenler kirpikli bakterilerde bulunur. O antijenin kirpikli olsun kirpiksiz olsun bütün bakterilerde bulunan vücut antijenidir. Birde insanlardan geni izole edilen Salmonella bakterilerinde bulunan ve ancak birkaç ay gibi kısa bir süre için saptanabilen Vi-antijeni bulunur. Vi-antijeni insan topluluklarında tifo partiküllerini saptamak için faydalıdır. H Antijenin Hazırlanması: Bakterilerin hareketli olması gerekir. Gerekirse yavaş hareketli suşlar % 0,4’lük yumuşak agarlı B.Y giderek hareketleri güçlendirilebilir. Bakterinin S koloni yapan hareketli suşu alınır 37 C 24 saatlik Buyyon kültüründen petri kutusunda K.B.Y ‘de ekim yapılır. Bol miktarda B.Y’ne ekilen bakterinin tüm yüzeyde bir tabaka şeklinde üremesi sağlanır.(24 saat). Daha sonra petri kutusunun içine birkaç damla steril fizyolojik tuzlu su koyulur. B.Y’den parça koparmadan bakteriler sıyrılır ve koyu bir süspansiyon haline getirilirler. Steril pipetle steril bir tüpe aktarılan bu süspansiyona % 0,1 ile % 0,2 düzeyinde formalin katılıp çalkalanır. 24 saat buzdolabında bekletilir ve daha sonra sterilite kontrolü yapılır. Formalin bakterilerin taşıdıkları O-antijenini yok eder. Böylece süspansiyonda H-antijenleri kalır. Sterilite sağlanmış ise uygun tamponlu sıvılarla standart bulanıklığa ayarlanan süspansiyon buzdolabında aylarca kalır ve kurumaya başlar. O-antijeninin Hazırlanması: Bakterilerin mümkünse hareketsiz suşları seçilir, buna imkan yoksa bakteri içerisine 1/800 veya 1/400 düzeyinde fenol katılmış jeloz B.Y’ne eklenerek kirpiksiz üremesi sağlandığı gibi varsa Vi-antijenini de yok edilmesi sağlanır. 37 C’de 24 saat kadar bir tabaka şeklinde üretilen bakteriler steril fizyolojik tuzlu su içerisinde koyu bir süspansiyon haline getirilirler. Bu süspansiyonun hacminin 10-20 katı hacmi de %95’lik alkol süspansiyonuna katılır ve bakterilerin taşıyabilecekleri H-antijenleri yok edilir. Alkollü karışım 40-50 C yarım saat kadar bekletilir, daha sonra bir gece karanlıkta oda sıcaklığında tutulur alkolün uzaklaşması için santrifüj edildikten sonra üst kısım atılır çöken bakterilerin uygun miktarda steril fizyolojik tuzlu suda süspansiyon haline getirilirler. Süspansiyona % 0,25 düzeyinde kloroform kullanarak konserbasyon sağlanır. Bu haliyle buz dolabında saklanır. Kullanılacağı zaman uygun sulandırmada uygun süspansiyonlar hazırlanır ve kullanılır. Testin yapılışı 8 tane tüp alınır. 1.tüpe 0,9 ml diğer tüplere 0,5 ml steril fizyolojik tuzlu su konulur. Hasta serumundan 1. tüpe 0,1 ml konur tüp çalkalanır bu karışımdan 0,5 ml alınarak 2. tüpe konur. Tüp çalkalanır. Bundan alınan 0,5 ml üçüncü tüpe konulur ve bu böyle 7 tüpe kadar devam eder. 7. tüpten alınan 0,5 ml karışım atılır, daha sonra tüplerin hepsine 0,5 ml antijen konur tüpler çalkalanır ve 1/3’ü suya batacak şekilde benmary’e konulur.(aglütinasyon testleri daima su banyosunda yapılır). H aglütinasyonu arıyor isek 37 C 2 saat oda sıcaklığında yarım saat tutmamız genellikle yeterlidir. O aglütinasyonu aradığımızda 37 C 4 saat bekledikten sonra genellikle oda sıcaklığında ve karanlıkta 1 gece (24 saat olabilir) beklettikten sonra sonuçlar okunur. 8.tüpte sonucun (-) olması lazımdır. Bu tüpte pozitif görüntü varsa test geçersizdir çünkü bizim antijen bozuktur.(serum olmayan tüpe pozitif sonuç verdiği için). Sonuçlara Bakılması: Negatif sonuçta süspansiyonda ki bakteriler tüpün dibinde son derece ince ve düzgün kenarlı düğme görüntüsü veren bir çökelti yapar. Pozitif sonuçlarda ise bakteriler irili ufaklı yumaklar oluşturarak kenarları girintili çıkıntılı kalın bir çökelti halinde dipte toplanırlar çoğu kez görüntü tüpün kenarlarına doğru tırmanmış görünür. H aglütinasyonunda kümeler büyüktür tüp çalkalandığı zaman bunlar daha küçük parçalara dağılırlar. O aglütinasyonunda ise kümeler küçüktür çalkalanma ile dağılmazlar. Tüp çalkalandığı halde üst sıvının berrak kalması sonucun (++++) olduğunu gösterir. Hafif kullanılan (+++) yarı yarıya kullanılan (++) kümelerin hemen tamamen dağılıp dipte sadece az bir miktar sağlam çökelti kalması (+) olarak değerlendirilir. Staphylococ ve Streptococ gibi bakterilerin tuzlu su veya buyyon süspansiyonları sulandırılmış veya sulandırılmamış hasta serumu ile lam üzerinde 1 er damla şeklinde karıştırılırlarsa kısa sürede gözle görülebilir veya mikroskobun küçük objektifi ile ayırt edilebilir. Aglütinasyon meydana getirebilirler. Kantitatif olmayan bu aglütinasyon testine lam aglütinasyonu adı verilir. Brucella Antijeninin Hazırlanması: Brucella bakterilerinin antijenleri ortak olan abartus suis ve meditensis türleri çok yaygındır. Brucella antjenlerini hazırlamak için genellikle Abortus türü kullanılır. Büyük petri kutularına veya geniş yüzey sağlanan özel şişelere dökülmüş jeloz B.Y üzerinde bakterilerin 48 saatlik kültürü hazırlanır. Birkaç damla steril fizyolojik tuzlu suda koyu bir süspansiyon haline getirildikten sonra % 0,5 fenol veya formalin katılarak sterilizasyon sağlanır. Bir gece bekletildikten sonra sterilite kontrolü yapılır. Sterilite sağlanmış ise uygulama bulanıklığına ayarlanıp kullanılır. Gruber Widal Testi Tifo enfeksiyonlarının teşhisinde kullanılacak kadar tifo geçirmiş insanlarda serumda ki antikorların saptanması amacıyla yapılan bir testtir. Enfeksiyonlar en çok salmonella typhi ve salmonella paratyhphi-B ile meydana geldiğinden bu testte kullanılan antijenler bu bakterilerden hazırlanabilirler. Tifo enfeksiyonunda O-Aglütininleri, H-Aglütininlerinden daha erken ortaya çıkarlar fakat spesifik değildirler. Yani salmonella tyhpi’mi yoksa salmonella parathypi-B suşuylamı enfeksiyon geçirilmekte olduğunu belli edemezler. H Aglütininleri ise hem spesifiktirler hemde serumda sadece bir yıl kadar kalabilen O-Aglütininlerine göre daha yıllarca varlıklarını sürdürürler. Sağlıklı insanların 1/40-1/50 sulandırılmış serumları bu testte (+) sonuç verdiğinden en az 1/100 ve daha yukarı sulandırılmalar yapılmalı ve sonuçlar değerlendirilmelidir. Kişinin serumunda O-Aglütininleri 1/100 H-Aglütinleri 1/200 titresinde bulunuyorsa o zaman kişinin hastalık geçirmekte olduğu düşünebilir. Bir süre sonra her iki aglütinin grubu da daha yüksek düzeylere çıkar. Eğer kişinin serumunda O-Aglütinasyonu 1/200 H-Aglütinasyonu 1/400 gibi yüksek bir düzey gösteriyorsa o kişi kısa bir süre önce tifo geçirmiştir. Serumunda sadece H-Aglütinasyon titresi (+) olan (1/100-1/200) insanların ya aşılanmış olduklarına yada iki veya daha fazla yıl önce tifo geçirdiklerine karar verilir. Tifo ile bağlantısı olmayan herhangi bir ateşli hastalıkta Gruber Widal testinde etkili olan H-Aglütininlerinin bir miktar arttığı bulunmuştur. Tifo portörlerinde Gruber Widal testi (+) sonuç verir. Bazen serumda çok yüksek düzeyde antikor bulunduğu halde yaptığımız aglütinasyon testinde serumu fazla sulandırmışsak isek aglütinasyon meydana gelmez. Buna Prozon olayı denir. Aynı serumu daha ileri düzeyde sulandırdığımız taktirde aynı antijenle mükemmel antijen meydana gelecektir. Neden kaynaklandığı tam olarak bilinmiyorsa da özellikle buruccella enfeksiyonları gibi prozon olayının görülme ihtimali olan durumlarda serum sulandırmalarını 1/400’den daha fazla en iyisi 1/800 kadar yapmak tavsiye edilir.(Buruccella enfeksiyonlarında Sub-Kronik devreye girdiği zaman serum sulandırmaları 1/1000 ile 1/10000 oranında (+) sonuç verebilir. Prozon olayına sebep olan faktörlerin hasta serumunun 56 0C’de 30 dk. tutulmasıyla kısmen veya tamamen elimine olduğu ileri sürülmektedir. Ancak en etkili tedbir yüksek düzeyde sulandırma yapmaktır çünkü yüksek sıcaklıkta serumdaki antikorlarda bozulabilirler. Bakteri Hemaglütinasyonu Bir çok bakteri Rickettsia, bazı mantarlar ve virüslerin bazıları çeşitli tipteki omurgalı hayvan eritrositlerini aglütine etme yeteneğindedirler. Bu olaya kısaca Bakteri Hemaglütinasyonu denir. Çoğu kez bakteriler söz konusu eritrosit süspansiyonlarıyla karşılaştıklarında ayrıca bir katkı gerçekleşmeksizin eritrositleri aglütine ederler. Bakterilerin bu davranışında tüm bakterilerde görülebilen ve adına Fimbria denilen ince ve sert yüzey eklentilerinin yol açtığı kabul edilir.(Fimbria’lar Gr(-) bakterilerde yaygındır). Bu olay direkt bakteri hemaglütinasyonu olarak tanımlanır. Bakteri hemaglütinasyonunun 2.bir tipinde bakterilerin yüzey antijenlerini oluşturan polisakkarit kökenli bileşikler eritrositlerin yüzeyine yapışırlar. Ancak aglütinasyon meydana gelmez. Bu karışıma kullandığımız bakteriye karşı homolog antikor taşıyan bir serum ilave edilirse eritrositlerin aglütine olduğu görülür. Buna İn-direkt Bakteri Hemaglütinasyonu denir. Eritrositlere yapışan ve antikorlaral tepkimeye girerek onların aglütine olmasını sağlayan polisakkarit kökenli bileşiklere Eritrosi Hassaslaştıran Madde (ESS) adı verilir. Presipitasyon Reaksiyonları Serolojik testler de herhangi bir partikül üzerine bağlı halde olmayan çözelti haldeki antijenlerle hasta serumunda bulunan ve yine çözelti halindeki antikorların uygun sulandırmaları ile birbirine karıştırmaları durumunda başlangıçta ortamda bulunmayan küçük partiküllerin meydana geldiği bunların birleşmesiyle , birleşmesi sonucu bulanıklık şeklinde görünen bir çökelmenin oluştuğu bilinmektedir. Bu olaya Presipitasyon denir. Bunu meydana getiren antijenlere Presipitinojen antikorlara Presipitin adı verilir. Antikor ve antijen çözeltilerinin optimal presipitasyon verdiği sulandırma düzeylerine Optimal oran adı verilir. Bu oran korunduğu taktirde presipitasyon elde etmemiz her zaman mümkündür. Örneğin daha önceki çalışmalarımızda elimizdeki antijenin 1/100 sulandırılmış şekli ile standart (+) serumların 1/20 sulandırılmış şekillerinin birbiri ile karışması durumunda optimal presipitasyon oluştuğunu bulmuş olalım. Aynı antijeni 1/200 sulandırdığımız taktirde yine optimal presipitasyonun elde edilmesi serumu 1/40 sulandırmamız yeterlidir. Presipitasyon testlerinde antijen çözeltileri çok pahalıdır. Mümkün olan en az düzeyde antijen kullanılması hedeflenir. Bu amaçla Mikropresipitasyon yöntemi geliştirilmiştir. 50-100 mikrolitre kapasiteli kapiller pipetler önce hasta serumuna daldırılır kapiller çekim yüksekliğinin yarısına kadar doldurduktan sonra antijen çözeltisine daldırıp bir miktar antijen çözeltisi kapiller tüpün içine çekilirse fiziksel karışım etkisinde kalmadan iki sıvının birbirine temas ettiği yüzeyde karşılıklı diffüzyon gerçekleşir. Bu sırada antijenle antikor arasında optimal oranın sağlandığı bölgede presipitasyon bandı(halkası) meydana gelir. Daha sonraları jel difüzyon teknikleri adıyla bilinen jeloz bulunan ortamlarda diffüzyon esasına dayanan uygumlalar geliştirilmiş. Bu teknikler kendi içinde ikiye ayrılır. 1. Antijen veya antikordan sadece birinin düffüze olduğu basit diffüzyon sistemleri ile 2. hem antijenin hem antikorun ortama diffüze oldukları çift diffüzyon sistemleridir. Her iki sistem kendi içinde tek yönlü ve İki yönlü olmak üzere iki tipe ayrılır. 1.a)Tek yönlü basit diffüzyonda serum karıştırılmış jeloz deney tüpünün içine konur katılaştıktan sonra üzerine antijen çözeltisi ilave edilir. Üst kısımdan vertikal yönde jeloz içine diffüze olan antijenler optimal oranın sağlanmadığı noktada presipitasyon bandı meydana getiriler. 1.b) iki yönlü basit difüzyonda içine serum katılmış jeloz petri kutusuna dökülür. Katılaştıktan sonra jeloza açılan bir oyuğa antijen çözeltisi daldırılır veya antijen çözeltisi emdirilmiş bir filtre kağıdı parçası jelozun üzerine yerleştirilir. Antijen hem vertikal hem horizontal yönlerde jeloz içine diffüze olur. Optimal oranın sağlandığı yönlerde presipitasyon çizgileri meydana gelir. 2.a)Tek yönlü çift difüzyon sisteminde tüpün içine önce serum katılmış bir miktar jeloz konur. Katılaşması beklenir. Bunun üzerine ikinci tabaka olarak içine hiçbir şey katılmamış bir miktar jeloz konularak katılaşması beklenir. Son olarak tüpün içine bir miktar antijen çözeltisi konulur. Serum alttan yukarıya doğru antijen yukarıdan aşağıya doğru ara bölgedeki jeloza diffüze olurlar. Optimal oranın sağlandığı yerde presipitasyon bandı meydana gelir. 2.b) İki yönlü çift difüzyon uygulamasında içine hiçbir katkı yapılmamış jeloz petri kutusuna dökülür katılaştıktan sonra petri kutusunun kenarlarından ve birbirinden uygun uzaklığa yerleştirilmek üzere test edilecek serumların emdirildiği filtre kağıtları jeloz üzerine yerleştirilir. Kutunun tam ortasına da antijen emdirilimiş filtre kağıdı konur. Hem antijen hem de serumlar hem horizontal hem de vertikal yönlerde jeloza diffüze olur. Optimal oranın sağlandığı bölgelerde presipitasyon çizgileri meydana gelir. Bir tek antijen çözeltisi aynı anda 4-6 farklı seruma karşı kullanma olanağı verdiğinden bu teknik en tasarruflu uygulamadır. Günümüzde tek yönlü basit difüzyonu anımsatan fakat elektrik akımı yardımıyla antijenin serum katılmış jeloz ortamında horizontal olarak sürüklenmesini sağlayan immün Elektroforez tekniği kullanılmaktadır. Kompleman Birleşme Reaksiyonları Kompleman bütün memeli hayvan serumlarında bulunan bir serum birleşmesidir. İmmünolojik reaksiyonlarda çok önemli bir görevi vardır. Aralarında ayrım yapılmaksızın vucudun neresinde bir antijen ve onun homolog antikoru arasında bir ilişki kurulmuş ise (Antijen-Antikor kompleksi) kompleman bu kompleksin üzerine yapışır ve bu üçlünün bulunduğu bölgede var olan membranlar veya biyolojik çatkılar tahrib edilirler. Örneğin bakterilerde yapılan bir aglütinasyon testinde hasta serumunda ki kompleman önceden yok edilmiş ise aglütinasyon meydana geldiği taktirde kısa süre içinde bakterilerin eridikleri görülecektir. Her antikor-antijen birlikteliği komplemanı bağlamasada çoğu kez kompleman bağlanması görülür ve vücüdun yüksek organizasyonlu parazitlere karşı en önemli bağışıklık reaksiyonlarından birini oluşturur. Tıpkı presipitasyon reaksiyonlarında olduğu gibi antijen-antikorun her ikisininde çözelti halinde birbirleriyle karşılaştığı ortamlarda da ortamda kompleman varsa meydana gelen antijen-antikor kompleksine bağlanır. Ancak ortamda lizi olduğunu gözleyebildiğimiz hücreler yoksa biz bu reaksiyonu saptayamayız. Oluşturduğumuz karışımda da bulunan antijen ve antikorun birbirinin homoloğu olduğunu ve ortamda kattığımız komplemanında ortamda ki antijen-antikor kompleksine bağlandığını görünür hale getirmek için biz deneyin son aşamasında ortama koyun eritrositleri ile bunlara karşı tavşanlardan elde edilmiş anti-serum karışımını ilave ederiz. Tavşan serumu+koyun eritrositi karışımı Hemolitik Sistem adıyla bilinir. Hemolitik sistem antijen-antikor-kompleman arasındaki ilişkinin görsel olarak ortaya konulmasına yardımcı olur. Kompleman birleşmesi deneyleri diğer reaksiyonlarla varlıkları anlaşamayan bazı antikorların antijenleri ile karşılaştıklarında komplemanı bağlama özelliklerinden faydalanarak yapılarlar. Bunlar arasında en tanınmışı Wassermann testidir. 1906 yılında frenginin teşhisi ve tedavinin başarı yönünden kullanılmak üzere tarif edilmiş bir testtir. Çok sayıda kobaydan serum alınıp karıştırılarak hemoliz yeteneği ön testlerle saptanan komplemandan wassermann testinde belirili bir miktar kullanılır. Bu testi ilk tarif ettiğinde wassermann frengili bir fetusun karaciğerinin sudaki ekstraktıını antijen olarak kullanmıştır. Daha sonraları sağlam insan karaciğerinden,sığır kalbinden,sığır böbreğinden antijen hazırlanabileceği anlaşılmıştır. Günümüzde sığır kalp kasının alkolde ki ekstraktı kullanılmaktadır. İçerisinde bir miktar Lecitin katıldığında hassasiyeti daha da güçlenmektedir. Kalp kasının alkolde eriyen ana asetonda erimeyen bu ekstrakt fragsiyonunu nasıl olupta treponema pallidum antijeni yerine geçtiği tam olarak anlaşılmamıştır. Kabul edilen bir teoriye göre bu antijen Reagnin adı verilen ve frengili hasta serumunda bulunan bir miktarda birleşmektedir. Komplemanda bu antijen-antikor kompleksine bağlanmaktadır. Reagnin nasıl meydana geldiği şu şekilde açıklanmaktadır. Treponema pallidum ürediği dokuları harab etmektedir. Hücrelerden lipoid karakterli bazı bileşikler serbest kalmaktadırlar. Bu lipoidler orada bulunan spiroket proteinlere yapışarak hapten rolü oynayıp proteinlerle birlikte oluşturdukları bu yeni yapıya karşı antikor ulaşmasını başlatmaktadırlar. Bu antikorda Reagin’dir. Wassermann testi için kullanılan komplemana uygun miktarlarda antijen alınmaktadır. Test iki aşamada yapılır.1.Aşama da biri test diğeri kontrol olmak üzere alınan iki tüpe aşağıdaki materyal konur. Test Kontrol 1/5 hasta Serumundan 1 Hacim 1 HacimAntijen 1 Hacim 1 Hacim fizyolojik tuzlu suKompleman 1,25 MHD 1 MHD Bu üç materyal tüplerde karıştırılır.37 0C benmary de 1 saat bekletilir. Sonra her iki tüpe hemolitik sistem test tüpüne 2 hacim kontrol tüpüne 2 hacim 37 0C 30 dk. bekletilir ve sonuç okunur. Wassermann testinin sonuçları incelenirken hareket noktamız 1.aşamada oluşan reaksiyonların sonunda ortama ne kadar serbest kompleman kaldığıdır. 2. aşamanın sonunda ortaya çıkacak görüntünün serbest kalmış kompleman miktarı ile doğru orantılı olarak değişeceği unutulmamalıdır. Hasta serumunun içerisinde ne kadar antikor olduğunu bilmemize gerek yoktur. Önemli olan bizim birbirlerine orantılı olarak tüplere ilave ettiğimiz antijen kompleman ve hemolitk sistemdeki koyun eritrositleri ile bunlara karşı tavşanlardan elde edilmiş antikorların miktarları önemlidir. Bu oranlar daha önce yapılan araştırmalardan elde edilen sonuçlara göre seçilmişlerdir. Wassermann testinin sonucu 3 şekilde karşımıza çıkar.1- Bütün eritrositler sağlamdır: Bu görüntü bize test tüpüne hemolitik sistem katıldığı anda ortamda hiç serbest kompleman bulunmadığını gösterir. Hemolitik sistemin içindeki koyun eritrositleri ile tavşan serumu antikorları kompleks oluşturmuş olsalar bile bu komplekslere bağlanacak kompleman olmadığından bütün eritrositler lizi olmadan kalmıştır. Demek ki 1 aşamada verdiğimiz antijen ---------------------------------------------- hasta serumu antikorla birleşmiş ve antijene orantılı olarak karışıma ilave ettiğimiz komplemanın tümü bu komplekslere bağlandığından ortamda serbest kompleman kalmamıştır. Deneyin sonucu hasta açısından (++++)’dir. Yani hasta kişi tam anlamıyla ölebilir.2- Eritrositlerde çeşitli düzeyde lizi görülmektedir: Bu sonuç eritrositlerin sağlam kısmı azaldıkça 1 aşamadan 2 aşamaya o denli fazla miktarda serbest kompleman kaldığını ve dolayısıyla hasta serumunda o denli az antikor bulunduğunu gösterir. Eritrositlerin bir kısmı lizi olmuş çoğu sağlam ise (+++)’dir. Eritrositler yarı yarıya lizi olmuş sonuç (++)’dir. Eritrositlerin büyük çoğunluğu lizi olmuş birkaç tane eritrosit var ise sonuç (+)’dir.3- Bütün eritrositler lizi olmuşlardır: Testin 1 aşamasında hasta serumuna ilave ettiğimiz antijen serumda kendisi için homolog olan antikor bulunmadığı için kompleks oluşturamamamıştır. Karışıma ilave ettiğimiz kompleman bağlanacak komplejs bulamadığından tamamıyla serbest halde bulunmaktadır. 2.aşamada ortama ilave edilen hemolitik sistemin antikor yapışmış eritrosit yüzeylerine ortamda ki kompleman bağlandığından ve kompleman bağlanmamış eritrosit kanladığından bütün eritrasitler lizi olmuşlardır. Sonuç kişi hasta değildir.(-) Flouresan Antikor Tekniği : U.V ışık ile karşılaştıklarında sarı-yeşil ışık kaynakları şeklinde görülen bazı boyalar belirli antikorlarla bağlandıklarında bu antikorların homologu olan antijenlerin flouresans veren (sarı-yeşil ışıldayan) duruma gelmelerini ve tanınmalarını sağlarlar. En çok kullanılan 2 flouresan boyası 1. Flourecin İzocyonat 2. Flourecin İzotiyonat’tır Özellikle virüslerin veya derin dokulardaki parazitlerin veyahut ta spiroketler gibi kolay boyanmayan mikroorganizmaların çeşitli muayene maddelerinde veya dokularında görünür hale getirilmesi için kullanılır. Çok hızlı bit teşhis metodudur. Ancak çok ender olarak hatalı sonuç verebilir. Kapsül Şişmesi Reaksiyonu: Kapsüllü bakterilerin muayene maddelerinde veya kültürlerde kapsül antijenlerine karşı antikor taşıyan serumla karşılaştıklarında kapsüllerini normalden birkaç kat daha görüntü verecek şekilde şiştiği fark edilmiştir. Diploccoccus pneumoniae (pneumoccoccus) menenjitlerin hızla teşhisi için çok uygun bir testtir. Ayrıca bu bakteriler arasında tip tayini yapmamızada yardım eder. Muayene maddesi veya kültürden alınan örnek lamın üzerine yayılır havada kurutulur. Kuruyan preparatın uygun bir bölgesine içinde pneumoccoccus antijenlerine karşı antikor bulunan 1.damla serum damlatılır ve metilen mavisi çözeltisinden bir miktar bu serumla karıştırıldıktan sonra preparat bir lamel ile kapatılır. 5-10 dk. bekledikten sonra mikroskopta muayene edilen preparatta maviye boyanmış bakterilerin etrafında geniş bir boyanmamış kapsül bölgesinin görülmesi bakterinin pneumoccoc olduğunu gösterir. Kapsül bölgesi ince kalmış ise bakteri pneumoccoc değildir. (-) sonuçlarda preparatın 1 saat sonra tekrar incelenmesi tavsiye edilir. Deri Duyarlılık Deneyleri Aşırı Duyarlılık: Bazı enfeksiyonlarda enfeksiyon etkeninin vucutta bulunup bulunmadığı anlaşılmadığı gibi varsa vucudun neresinde yerleşmiş olduğuda klorik serolojik yöntemlerle gösterilememektedir. Ancak varlığı araştırılan mikroorganizmaya ait kültür ekstraktları yahutta bu mikroorganizmayla hastalanmuş hayvanlardan elde edilen doku ekstraktları bu mikrooraganizmayı taşıyan kişilerin derilerine verildiği taktirde deride aşırı bir tepki ortaya çıkmaktadır. Bu tepki kızarıklık ve birkaç gün süren yarım ile bir cm çaplı bir sertlik şeklinde kendini belli eder. Buna aşırı duyarlılık denmektedir. Mycobacterium Tuberculosis’i insan vucudunda bulunup bulunmadığını veya insan bu bakteriyle karşılaşıp karşılaşmadığına bağlı olarak yapılan deri hassasiyet testlerine Tüberkülin testleri adı verilir. İnsan veya sığır tipi tüberküloz mikrobunun %4’lük gliserinli besiyerinde 6 hafta üretildikten sonra B.Y’nin 70 0C sıcaklıkta tutularak hacminin 1/10’u kalacak şekilde yoğunlaştırılması tüberkülin elde etmek için takip edilen yoldur. Bu şekilde konsantre hale getirilmiş kültür 100 0C 1 saat (30dk.-1saat) tutulduktan sonra steril filtreden süzülür ve artık Old Tüberkülin olarak adlandırılır. Old tüberkülin bazı insanlarda başka yönde alerjik tepkilere yol açtığından günümüzde tüberkülin testleri çok daha hassas ve yan etkisiz preparat olan P.P.D’ler ile yapılmaktadır.(Purifred Protein Derivates=Arıtılmış protein türevleri). Old tüberkülinin 1/10000 sulandırılmışının 0,1 ml’sinde 0,01 mg tüberkülin vardır. Buna bir tüberkülin ünitesi denir. Tüberkülin testleri yaklaşık olarak 5 ünite tüberkülin ile yapılır. (-) sonuç alınırsa 100 tüberkülin ünitesi ile tekrar edilir. Tüberkülin testlerinde (+) sonuç tüberkülin uygulanan bölgede deride en az yarım cm çaplı sertlik ve kızarıklık şeklinde kendini belli eden ve (+) sonuçta o kişinin daha önce mycobacterium tuberculosis ile karşılaştığını ve bu bakteriye karşı belirli bir düzeyde reaksiyon geliştirdiğini gösterir. Bu kişilere aşı uygulanmaz. (-) sonuçta tüberkülin verilen bölgede herhangi bir reaksiyon görülmez buda bize o kişinin 2 ay öncesine kadar tüberküloz mikrobu ile karşılaşmadığını gösterir. Bu kişiler aşılanır. Mono Testi: Ön kol derisi asetonla temizlenir buraya sulandırılmış veya düşük düzeyde sulandırılmış tüberkülinden 1:1 lanolin karıştırıldıktan sonra derinin üzerine damlatılıp bu bölge 1 dk. kadar ovuşturulur. Aynı testi tüberkülini bir parça filtre kağıdı damlatıp kağıdı temizlenen deri bölgesine koyup bir flaster ile kapatmakla mümkündür. 48 saat sonra tüberkülin uygulanan deri bölgesi incelenir. Deride küçük sert kabarcıklı bir kırmızılık görülmesi (+) sonucu gösterir. (-) sonuçta hiçbir reaksiyon görülmez. Pirquet Testi: Ön kol derisi alkolle temizlenir derinin üzerine sulandırılmış veya sulandırılmamış tüberkülinden bir damla damlatılır sonra sivri uçlu temiz bir iğne ile önce damlaladan 1 kaç cm uzağa yarım cm uzunluğundan ve birbirinden 2mm kadar uzakta duran iki çizgi çizilir. Daha sonra aynı işlem damlanın bulunduğu yerde tekrar edilir. Sadece epidermisin çizilmesine dikkat edilmelidir. Test ileri üç gün sonra değerlendirilir. Yarım ile 1 cm sertlik şeklinde damlanın bulunduğu bölgede reaksiyon reaksiyon görülmesi (+) sonuçtur. (Tüberkülin damlatılmayan yerdebu görüntü yoktur). Herhangi bir reaksiyon görülmemesi (-) sonuçtur. Mantoux: Deri içine uygulanan bu test en güvenilir sonucu vermektedir. Tüberkülin yaklaşık 1/20000 düzeyinde sulandırılır ve bunun 0,1 ml temizlenmiş ön kol derisi içine enjekte edilir. (+) sonuç 2-3 gün sonra görülür yaklaşık 1-2 cm bir sertlik şeklinde kendini belli eder . (-) sonuç alındığında daha az sulandırılmış tüberkülinden 0,1 ml enjekte ederek testi tekrar edebiliriz. Deri altına tüberkülin kaçırmamaya dikkat edilmeli. Volmer Testi: Tüberkülin damlatılmış bir flaster kullanılır genellikle sternum derisine uygulanır. Flaster temizlenmiş sternum derisi üzerine yapıştırılıp 48 saat burada bırakılır. Daha sonra kaldırılarak sonuç okunur. Tüberkülinin rast geldiği yerlerde küçük kabarcıklı sertlik görülmesi ve derinin kırmızı renkli olması (+) sonucu gösterir. (-) sonuçta reaksiyon görülmez. Diğer Duyarlılık Testleri Memeli hayvan vucudunda sadece O,H,Vi antijeni gibi klasik antijenlere karşı antikor sentezlenmez. Toksin üreten bakterinin toksinlerini nötralize etmek üzere antitoksin adı verilen antikorlarda üretilir. Bir insanın toksin üreten herhangi bir bakteriye karşı bağışıklık geliştirip geliştirmemiş olduğu bakteri toksinlerinin deriye enjekte edilmesi ile kolayca anlaşılır. Bu testlerde değerlendirme tüberkülin testlerinde yürütülen mantığın tam tersi ile yapılır. Bu testlerin (+) sonuç vermesi verilen toksinin deride lokal bir bozukluk meydana getirmesi demek olup (+) sonuç veren insanların test edilen bakteriye karşı antikor taşımadıklarını gösterir bu insanlar aşılanır. (-) sonuç vermesi durumunda ise kişinin serumunda en azından verilen miktar kadar toksini nötralize ederek zararsız hale getirecek kadar antitoksin var demektir kişi bu bakteriye karşı bağışıktır aşı yapılmaz. Dick Testi: kişilerin streptococ toksinlerine karşı duyarlı olup olmadığını araştırmak için kullanılır. Streptococların kızıl enfeksiyon yapanları eritrojen toksin adı verilen bir toksin üretirler bu toksin kapiller kanamalara sebep olur ve kızılda derinin exortten adı verilen kırmızı lekeler oluşturmasına yol açar. Eritrojen toksin temizlenmiş ön kol derisi içine önce ısıtılmadan 0,1 ml enjekte edildikten sonra 96 0C 45dk. ısıtılıp soğutulduktan sonra diğer kolun derisinin içine aynı miktar enjekte edilir. (+) reaksiyon 6.-16. saatler arasında başlayan 48. saate kadar giderek genişleyen 1 cm çapında bir kızarıklık oluşur.(erithem). Genellikle bundan sonra rengi solmaya başlayan deride kahverengi bir leke uzun süre kalır. Bu o kişinin kızıl streptococuna hassas olduğunu aşılanması gerektiğini gösterir. Isıtılmış toksinin verildiği kolda reaksiyon görülmez. Her iki koldada reaksiyon görülmemesi (-) sonuçtur, o kişide kızıl streptococ toksinini nötralize edecek kadar antitoksin bulunmaktadır. Schick Testi: Kişilerin diphtheriae toksinine hassas olup olmadıkları için kullanılır. Eğer bir insanın serumunda 1ml’de 1/200 ml antitoksin varsa o kişide bu test (-) sonuç verir. Çünkü verilen toksin nötralize edilmektedir. Her iki kolun derileri asetonla silinir bir kola derinin içine normal diphtheriae toksininden 0,1 ml enjekte edilir diğerinin derisi içine 70 0C ‘de 30 dk. ısıtılmış serumdan aynı miktar enjekte edilir. (+) reaksiyon genellikle 48 saatin sonunda çapı 1 cm kadar olan ve 3-4 güne kadar giderek genişleyen kırmızılık ve şişlik görülür. Yavaş yavaş gerilemeye başlasa da 1 hafta kadar yeri belli olur. Isıtılmış toksinin verildiği kolda ilk 6 saatte görülen kızarıklık tahriştendir daha sonra kaybolur. (-) sonuçta her iki kolda da reaksiyon görülmez. Büyük çocuklarda genellikle pseudopozitif reaksiyon adı verilen 24-48 saatte gelişip 2-3 günde kaybolan bir reaksiyon görülür. Aslında bu çocuklar difteriye dirençlidir aşılanmazlar. Net olarak (+) sonuç verenler aşılanır.(-) sonuç verenler zaten bağışıktır. Muayene Maddeleri Enfeksiyon hastalıklarından en kısa zamanda teşhisinin yapılabilmesi ve tedaviye başlanabilmesi klinik belirtiye göre şüphelenen enfeksiyon etkeninin en hızlı ve kolay tanınabileceği örneklerin alınabilmesi gerekirse uygun şekilde işlenebilmesi, gereken sıcaklıkta ve hızda laboratuara gönderilmesi şarttır. Rutin çalışmalarda bu amaçla alınan örneklerin tümüne ayırım yapılmaksızın muayene maddesi adı verilir. Hangi tip muayene maddesinin alınacağı bilgi ve deneyim gerektirir. Bazen hastalık belirtileri başka bir organ veya sisteme ait iken etkenin izole edilebileceği muayene maddesi başka bir sistemde bulunabilir. Bu konuda en güzel örnek çocuk felci enfeksiyonudur. Bu hastalığın etkeni olan virüs sindirim yolunda bulaşır diğer hiçbir organda klinik belirti vermeksizin merkezi sinir sistemine saldırır ve zaman zaman gevşek felç denilen çok olumsuz sonuçlar doğurur. Hastalanan sistem merkezi sinir sistemi olduğu halde bu virüs bol miktarda dışkıda bulunur. Balgam dış ortamda temas halinde solunum yollarımızın epitelyum yüzeyini örten mukoid bir salgıdır. Doğal olarak yaşadığımız çevreye bağlı olmak üzere tek hücreliden çok hücreliye kadar hayvansal organizma çeşitli mantar elemanları ve Gr(+) ağırlıklı olmak üzere geniş bir bakteri kirliliği taşımaktadır. Bu sebepten balgam normalde flora içeren bir muayene maddesidir. Boğaz salgısında normalde flora içeren bir muayene maddesidir. Buna karşılık tükürük gerek boğaz salgısı alırken gerek balgam örneklerini toplarken karışması arzu edilmeyen bir sindirim salgısıdır. Kan ve vucudun doğal boşluklarında bulunan sıvılar normalde steril muayene maddeleridir. Bunların alınması sırasında dışarıdan mikrop bulaştırmamaya mutlak özen gösterilmelidir. Bu muayene maddelerinde izole edilen her mikroorganizma o anda ki enfeksiyon etkeni kabul edilecektir. Balgam gibi muayene maddelerinde ise sadece belirli özellikler (mikroskobik makroskobik) ve sadece birkaç patojen mikroorganizma araştırılır. Boğaz salgısı için cornebacterium diphtheriae ve A grubu B-hemolitik streptococlar hedef patojenlerdir. Balgamda özel durumlar hariç neredeyse sadece tüberküloz mikrobu aranır. Dışkı normalde flora içeren en önemli muayene maddelerinden biridir. Burada da patojen protozonlar parazit yumurtaları veya vibriocholerae ile salmonella ve Shigella cinsine giren bakteriler aranır. İdrar aslında steril bir muayene maddesidir ama geçtiği yolların doğal florası ile kontamine olur bu yüzden normal yolla alınan idrar örneklerinin steril olması beklenemez. Belirli düzeyde bir bakteri kontaminasyonu değerlendirme dışı bırakılır. Bakteriler ve parazitler kana geçtiklerinde hastada yüksek ateş görülür. Bu devrede alınan kan örneklerinden enfeksiyon örneklerini izole etmek mümkün olur. Bruccelloz gibi subkronik bakteri enfeksiyonlarında periferik kandan alınan örneklerden bakteri üretilemezse kemik iliği örneklerinde neredeyse daima (+) sonuç alınır. Beyin Omurilik Sıvısı(B.O.S) merkezi sinir sistemini ilgilendiren bakteriel enfeksiyonlarda çok önemlidir. Cerahat bulunduğu yere göre mümkünse steril bisturilerle açılarak ekivyolla veya pastör pipetiyle alınır. Fazla derin olmayan soğuk apseler yine bisturi ile açılarak örnek alınır. Açık yaralar genellikle sekonder enfeksiyon etkeni ile doludur. Hatta miyoz yapan sineklerin larva ve yumurtaları da görülebilir. Göz enfeksiyonlarında alınan örnek göz salgısındaki lizozin sebebiyle hemen hastanının yanı başında B.Y’ne ekilir. Bunun dışında her muayene maddesinin ve bu muayene maddesinden izole edilmek istenen patojen mikroorganizmaların veya virüsün özelliğine bağlı olarak soğukta steril kaplarda veya B.Y içinde fakat en kısa zamanda laboratuara gönderme işlemi yapılır. Normalde Steril Olan Muayene Maddeleri Bu muayene maddelerinde dışarıdan karıştığına şüphe edilmeyen her türlü mikroorganizma üretilmiş olması veya virüs izole edilmiş olması enfeksiyon etkeninin elde edildiğini ifade eder. Çünkü sağlıklı vücutta bu muayene maddeleri sterildir. KAN: Birçok enfeksiyonun geliştiği devrede kanda enfeksiyon etkenini görmek ve bunu izole etmek mümkündür. Pneumoccoc pneumoleri gibi____________________________ bakteri menenjitleri tifo ve tifoya benzeyen salmonella enfeksiyonlarıyla B-Hemolitik streptococların ve staphylococcus aureus un etkin olduğu enfeksiyonlarda kandan bakteri elde edilir. Kanda çoğalmamak kaydı ile geçici süre ile bakteri bulunmasına bakteriyemi denir. Kanda da çoğaldığı durumlarda ortaya çıkan tabloya sepsis veya septisemi adı verilir. Tetanoz, diphtheriae, Shigelloz da kanda bakteri bulunmadığı için bu yönde araştırma yapılmaz. Kandan etkin mikroorganizmayı üretmek amacıyla yapılan işlemlerin tümüne hemokültür adı verilir. Doğumdan sonra hijyen koşullarının uygun olmaması sebebi ile loğusa kadınlarda ki loğusa humması gibi enfeksiyonlarda da kandan bakteri elde edilebilir. Bakterilerin kana geçmeleri ateş, titreme, halsizlik tablosu şeklinde kendini belli eder. Bu devrede kan örnekleri alınırsa bakteriyi izole etmek mümkündür. Brucceloz da belirli periyotlarda nöbet şeklinde gelen ateş vardır. Ateşli devrede veya ondan 30dk-1saat önceki sürede kan örnekleri alındığında brucella bakterilerini izole etmek mümkündür. Subakut Bakteriyel Endokarditis genellikle ateşsiz seyreden devrelerde bile uygun zamanda kan alındığı taktirde etken mikroorganizmanın izole edildiği bir enfeksiyondur. Zaman zaman ikişer saat aralar ile gün boyu kan almak gerekebilir. Doğal olarak hemokültür yapılacak kanın pıhtılaşmasına izin verilmez. Hassas bakterilerin zarar görmemesi için pıhtılaşmanın engellenmesi amacıyla kimyasal bileşiklerin kullanılması tavsiye edilir. Kullanılmak zorunluluğu varsa bol miktarda B.Y’ne ekim yapılarak bu olumsuz etki ortadan kaldırılmaya çalışılır. Alınan kan örnekleri 100 ml B.Y’ne 2-3 ml sıvı B.Y’ne ekilir. Ayrıca bakteri sayımı yapabilmek için uygun şekilde hazırlanmış ve 45-50 0C soğutulmuş tüpteki jeloza 1 ml kadar karıştırılıp petri kutusuna dökme tekniği ile K.B.Y’ne ekilir. Anaerob bakterileri aramak için tiyoglukolatlı buyyon kullanmak gereklidir. Normal buyyona ekim yapmak mümkündür. Zengin B.Y isteyen bakteriler bekleniyorsa astritesli buyyona ekim yapılabilir. Her biri 150 ml iki buyyona ekim yapılıp bunların birine %10 CO2 atmosferde (Mum yakılmış kavanoz) inkübe etmek tavsiye edilir. Petri kutusuna dökme yapılırken 20 ml jeloza 1 ml kan karıştırılır. Jeloz B.Y’de 24 saat sonra sadece yüzeyde 1-2 bakteri kolonisi (staphylococcus epidermytis gibi) görülürse bunların dışardan karışmış olabileceği düşünülebilir. Ancak B.Y’de hem yüzeyinden hem de iç kısımından aynı bakteriye ait 5-6 veya daha fazla koloni bulunuyorsa o zaman bunun enfeksiyon etkeni olduğu ihtimali yüksektir. Zaten aynı bakteri S.B.Y’de de üremiş olur. Staphylococcus aeuros-α ve β-Hemolitik str. Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, pneumoccoc, salmonella, proteus pseudomonas , pasteurella gibi cinslere girer. Bakteriler kandan elde edilebilirler. Ender olarak anaerob coreno bakteri ve mayalar kandan izole edilebilir. Brucella enfeksiyonlarında periferik kan örnekleri (-) çıktığı zaman kemik iliğinden alınan örneklerden büyük ölçüde (+) sonuç alınır. B.O.S: Zaman zaman Beyin Omurilik Sıvısı adıyla anılan bu muayene maddesi meningocephalit ve menenjit tablolarında çok değerli bir muayene maddesidir. Genellikle 5 ml kadar örnek yeterlidir. Aseptik koşullarda alınır. Steril şartlarda hızla laboratuara gönderilir. Neisseria meningitidis, diploccoccus pneumoniae Haemophilus influenzae ve mycobacterium tuberkulosis B.O.S’tan elde edilecek en ciddi patojenlerdir. Ancak bunların yanında streptococcus pyogenes ve staphylococcus aureus ta B.O.S’tan elde edilebilir. Ender olarak salmonella proteus ve pseudomonas B.O.S’tan izole edilmektedir. B.O.S örnekleri hem makroskobik hem mikroskobik incelemeye alınırlar. Makroskobik inceleme de berraklığına ve pıhtı içerip içermediğine bakılır. Genellikle lökosit sayımı yapılır. Kapsül şişmesi reaksiyonu uygulanabilir. Bakteri kültürü yapmak için 300 devirde 10-20 dk.kadar santrifüj edilip tüpteki örneği fazla çalkalamadan dipte 1 ml kalıncaya kadar üst sıvı dikkatlice alınır ve serolojik testler için gönderilir. Dip kısımdan mikroskobik muayene ve kültür için faydalanılır. Mikroskobik muayene 3 preparat şeklindedir. Bunlardan birisi gram diğeri metilen mavisi ile boyanırken üçüncüsü Ziehl-Neelsen ile boyanır. Gram boyama bize hiç olmazsa grubunu gösterir. Metilen mavisi ile boyanmış preparat bakterilerin Neisseria cinsine girip girmedikleri anlaşılmasına yarar. Ziehl-Neelsen ile hazırlanmış preparat bize tüberküloz hakkında bilgi verecektir. Aside dirençli bakteri görülürse hemen Locwenstein-jensen B.Y’ne ekim yapılır ve rapora bu konu yazılır. Kültür için kanlı jeloz veya Levinthal ile boyanmış kanlı jelozuna (Çukolata Jelozu) ekim yapılır. Anaerob bakteri şüphemiz varsa o zaman tiyoglukolatlı B.Y’ne (Sıvı veya Katı) ekim yapmamız tavsiye edilir. CERAHAT: Bakteriyel enfeksiyonların yüzeysel veya derin dokularda sebep oldukları çevresel yıkım ve buna karşı vücutta gelişen savunma reaksiyonlarının bir sonucu olarak cerahat adı verilen bir kitle meydana gelir. Açık yara daima dışarından bulaşmış sekonder enfeksiyon etkilerini de barındıran cerahat vardır. Fistül genellikle derin dokuları dışarıya veya vücut boşluğuna bağlayan bir enfeksiyon odağı olarak düşünülebilir ve cerahat oluşturur. Dış ortamla bağlantılı olduğunda burada da karma bir flora bulunabilir. Bunların cerahatları ekivyonla alınır iki ekivyonla alınan materyal birisi kültür diğeri preparasyon için kullanılacak şekilde değerlendirilir. Apse dışarıya açılmış olabildiği gibi henüz kapalı da olabilir. Apse cerahati genellikle saf kültür halinde bakteri taşır kapalı apse söz konusu ise deri önce tendirtiyotla temizlenir daha sonra apsenin üzeri kesilip pastör pipeti ile uygun miktarda cerahat örneği alınır. Yeterli miktarda apse varsa uygun enjektörle alınıp makroskobik muayene için tüpe veya petri kutusuna aktarılır. Makroskobik muayenede cerahatin kıvamına kokusuna rengine ve içinde tanecik bulunup bulunmaması bakılır. Staphylococ cerahati çok ince tanecikli homojendir krem rengi ve kıvamındadır. Streptococ cerahatinde girintili çıkıntılı beyaz tanecikler bulunur. Pseudomonas aeruginosa cerahati mavi yeşil ışıltı verir. Cerahat ta koyu renkli pis koku anaerob bakterilerden kaynaklanır. Cerahatin içerisinde sarı tanecikler varsa actinomyces bowis söz konusudur. Bir tanecik lam üzerine konur lamelle ezilirse actinomised yapısı açıkça belli olur. Soğuk apse denilen ve genellikle derin yerleşmiş apseler mycobacterium tuberkulosis taşıyabilirler. Bu sebepten cerahatin mikroskobik incelenmesinde iki preparat hazırlanır bunlardan biri gram diğeri ziehl-neelsen boyamadır. Gram boyama ile hangi bakterilerin söz konusu olabilceği tahmin edilebilir. Diğer preparat aside dirençli bakterilerin teşhisi içindir. __________ görülebilecek bütün patojen bakteriler cerahattan elde edilebilirler. Kirli yaralarda anaerob bakteriler çok sayıda bulunur. Kültür için iki kanlı jeloz veya levinthal kaynamış jelozu genellikle yeterlidir. Özel bir gereksinim varsa (Gr(-) bakteri aramak gibi) o zaman endojelozunada ekim yapılmalıdır. Kanlı jelozlardan biri aerob diğeri anaerob koşullarda tutulur. Genellikle ascitesli buyyona veya tiyoglukolatlı buyyona ekim yapılır. Aerob B.Y’de 3 gün içinde üreme olmazsa atılır. Anaerob B.Y’de ise 1.günün sonunda 2.günün sonunda ve 7.günün sonunda özeyle örnek alınıp gram boyama yapılarak bakteri üremesi araştırılır. Bakteri görülürse uygun B.Y’ne pasaj yapılır. Kirli ve derin yaralarda Clostridium perfringens aranır. Deride şarbon fronkülü var ise asla kanatmadan çıbanın kenarında ki doku hafifçe kazınıp çıkan seröz sıvı alınır, kültür ve preparasyon için kullanılır. Frengi şankr’ı karakteristik bir lezyondur. Treponema pallidum B.Y’de üretilemediğinden buradan kazınarak alınan seröz sıvı karanlık saha mikroskobunda incelenilerek spiroketler görülür. İDRAR: Doğal yollarla alınan idrar her ne kadar geçtiği bölgelerde ki florayla kirlenmiş olsa da bir miktar dışarı bırakıldıktan sonra alınan örnekte 1 ml’de 1000 kadar karışık kültür şeklinde bakteri bulunması normal sayılır. İdrarın her ne kadar makroskobik muayenesinde zaman zaman önem taşırsa da bizim için değeri olan mikroskobik muayenesidir. İdrarın bileşiminde üre bulunduğu için iyi bir B.Y’dir. Bu sebeple alınır alınmaz inceleme imkanımız yoksa hemen buzdolabına konmalıdır. Oda sıcaklığında 2saat bekletilmiş idrar atılır. Buzdolabında da 24 saati geçmiş ise artık muayene edilemez. Bakteri sayısının önemli olduğundan önce direkt olarak bakteri sayımı yapılmalıdır. Sayım için aerob koşullarda tutulan B.Y’ne ekim yapılır. Ancak mikroskop muayenesiyle de ortalama bakteri sayısı hakkında karar vermemiz mümkündür. İdrar ısıtma ile bozulduğunda bakteriler lama yapışmazlar. Lama yapışmayı sağlamak için önce lamın üzerine 1 damla serum damlatılır (veya 1 damla buyyon) sonra bu 1 damla idrarla karıştırılıp yayma preparat hazırlanır. 1mm’de 10000-100000 arasında bakteri varsa ve bu bakteriler az çok saf kültür görüntüsü veriyorsa enfeksiyon etkeni şüphesi yaratır. 20 ml’de 100000’den fazla bakteri enfeksiyonu göstermektedir. Tahmin ettiğimiz bakteri tipine göre kanlı jeloz veya endojeloza ekim yaparız. İdrarın aerob bakterilerle enfekte olduğu neredeyse hiç görülmediğinden anaerob kültür yapılmaz. Hazırladığımız preparat ta bakteriler seyrek düşmüş ve her objektif sahasında görülmeyecek kadar az sayıda iseler idrar normal kabul edilir. Her objektif sahasında bakteri görülüyor olması idrarın enfekte olduğunu gösteren işaretlerden biridir. Normal idrarlarda karma bir Gr(-) flora bazen buna ek olarak α-hemolitik streptococ ve staphylococcus albus gibi Gr(+) bakteriler bulunur. Enfekte idrarlarda ağırlıklı saf kültür şeklinde coliform bakteriler E-Coli, proteus türleri, salmonella, staphylococcus aureus, pasteurella, brucella, Neisseria cinsi bakteriler ve streptococcus pyogenes bulunabilir. Normalde Flora Taşıyan Muayene Maddeleri BOĞAZ SALGISI: Boğaz salgısı ağızda yaşayan bir çok doğal bakteri grubuyla floralanmış bir muayene maddesidir. Normalde flora taşıyan muayene maddelerinin şüphelenilen patojen bakteriyi izole etmek yönünde incelenmesi prensibinden hareket edilerek bu muayene maddesinin de başta iki patojen bakteriyi aramak için seçildiğini unutmamak lazımdır. Bunlar Corynebacterium diphtheriae ve A grubu B-Hemolitic streptococlardır. Normal boğaz salgısında hemoliz yapmayan streptococlar α-hemolitik streptoccolar, staphylococcus albus ve Neisseria catorralis gibi bakteriler bulunur. Az miktarda olmak üzere staphylococcus aureus Haemophilus influenzae diploccoccus pneumoniae gibi potansiyel patojen bakteriler bulunabilir. Boğaz salgısı ekivyonla alınır. Ekivyon boğazın yan duvarlarına küçük dil çevresine ve tonsillalar üzerine değdirilerek hareket ettirilir varsa yalancı zarın altına sokulur ve yanaklara dile değdirilmeden ağızdan çıkarılır. Corynebacterium diphtheriae ve A grubu B-Hemolitic str. Yanında Neisseria meningitidis Bordotella pertussis __________hatta mycobacterium tuberculosis bağaz salgısından elde edilebilir. Örnek alınan ekivyonun içerisine yarım ml kadar buyyon bulunan steril tüpe daldırılıp labaratuara gönderilmesi gerekir. genellikle iki ekivyonla örnek alınır 1. preparasyon hazırlanması Gr boyama Angina Vincenti dışında bize pek açıklayıcı sonuç vermez. Vincen Angininde preparatta bol miktarda spiroket ve fuziform bakteri görülür. Bu şüphe varsa gymsa ile boyanmış bir preparat hazırlanabilir veya karbon fuksin ile 3 dk. boyanmış bir preparat incelenir ve teşhis doğrulanır. Neisseria metodu ile boyanmış bir preparatta uçları şişkin ve ilk bakışta çin alfabesini hatırlatan bir görüntü veren bakterilerin görülmesi Corynebacterium diphtheria teşhisini kolaylaştırır. Boğaz salgısından kültür yaparken kanlı jeloz en uygun B.Y’den birisidir. A grubu B-hemolitik streptococ’ların bazıları O2 dayanıksız hemolizin ürettiklerinden kanlı jelozu azaltma metodu ile ekim yapmak üzere özeyi B.Y’de hareket ettirirken B.Y’nin birkaç yerine batırmamız tavsiye edilir. Böylece O2 hassas hamolizin üretenler B.Y’nin iç kısımlarında hemoliz meydana getirerek kendini belli ederler. O2 hassas hemoliz enzimi üretenlerin daha sağlıklı teşhisini istiyorsak o zaman kanlı jelozla petri kutusuna dökme yöntemini uygulayabiliriz. 37 0C 24-48 saat inkübe edildikten sonra sonuçlar incelenir. Bazen anaerob koşullarda kültür yapmakta gerekebilir. 37 0C 24 saat sonra kanlı jeloz üzerinde kenarları girintili çıkıntılı küçük grimsi renkli ve granüllü gibi görünen etrafları kahverengi koloniler görüldüğünde Corynebacterium diphtheria şüphesi vardır. Gerekirse Löfler B.Y’ne ve tellüritli kanlı jeloz B.Y’ne pasaj yapılır. 37 0C’de tellüritli kanlı jeloz üzerinde Corynebacterium diphtheria mitis tipi hemoliz yapması ile kendini belli eder. Gravis tipinin bazı suşları hemoliz yapar (çok hafif hemoliz). Bazıları yapmaz. Gravis veya mitis ayrımının tedavi bakımından herhangi bir öenmi yoktur. Boğaz salgısında Neisseria meningitidis izole etmek istiyorsak bu muayene maddesi bu amaca pek uygun değildir. Onun yerine Nasopharynx salgısı tercih edilir. Küçük dilin arkasında yumuşak damağın farinxe bakan duvarının internal burun deliklerine komşu yüzeyi Nasopharynx olarak adlandırılır. Ucu pamuğa yakın yerden hafifçe ayrılmış ekivyonla damağa ve dile dokundurulmadan ekivyon nasopharynx duvarına değdirilir ve dikkatle ağızdan çıkarılır. Nasopharyx salgısında mikrobik olarak bakteri arandığı gibi kanlı jelozda 37 0C’de 2-3 gün inkübasyondan sonra küçük grimsi ve mukuslu görünen ve hemoliz yapmayan koloniler gelişip gelişmediği araştırılır. Meningococ’ların %10 CO2 atmosferde daha iyi geliştiğini bildiğimizden mum yakılmış kavanoz metodu tavsiye edilir. Nasopharynx salgısı Bordotella pertussis boğmacanın etkeni olan izole edilmesinde de kullanılır. Ancak öksürük plağı adı verilen bir teknik daha uygundur. %15 kan ilave edilmiş Bordet Cengou B.Y petri kutularına dökülür(Bu B.Y’de sellektivite sağlamak üzere yüksek dozda peniciline vardır). Katılaşmış B.Y’nin bulunduğu petri kutuları öksürmekte olan hastanın ağzından 25-30 cm uzağa B.Y güneyi hastaya bakacak şekilde tutulup kapağı açılır ve bir süre beklendikten sonra kapak kapatılır. Öksürük sırasında ağızdan fırlayan damlacıklar B.Y’ne yapışırlar. 37 0C’de petri kutuları 4-5 gün sonra kontrol edilir. B.Y’de civa damlasına benzer küçük gri beyaz opak koloniler gelişmiş ise bakteri izole edilmiş demektir. Buradan alınan örneklerle serolojik testler yapılabilir veya flouresan antikor tekniği uygulanır. BALGAM: Akciğerde komplikasyon yapan sistemik enfeksiyonlar pneumoniea, akciğer apsesi, akciğer gangreni ve akciğer tuberkülozu gibi akciğere özel enfeksiyonlarda ve akciğeri tutan mantar enfeksiyonlarında balgam teşhis için en önemli muayene maddesidir. Bilinçli olmayarak yapılan bazı farklı amaçlı balgam muayenelerinde barsak nematodlarına ait larvalarda karşımıza çıkabilir. Balgam sabahları alındığında daha başarılı sonuç alınır. Balgamı alınacak hastanın dişleri fırçalanır temiz su ile gargara yapıldıktan sonra balgam çıkarması istenir. Kolay balgam çıkaramayanlar belden yukarısı yataktan aşağı sarkıtılıp 1-2 dk. sırtına vurularak balgam çıkarılması teşvik edilir. Balgamın biri makroskobik diğeri mikroskobik olmak üzere iki inceleme şekli vardır. Makroskobik incelemede balgamın 24 saatlik miktarı kokusu rengi ve kıvamı önemlidir. Sağlıklı insanların balgamlarında az sayıda olmak kaydıyla Diplococcus pneumoniae, Neisseria catarallis, Haemophilus influenzae, hemoliz yapmayan staphy streptococ’lar, bazı staphylococ lar karma flora şeklinde bulunabilir. Ancak Mycobacterium tuberculosis, Bordotella pertussis, Bacillus anthracis, Clepsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Pasteurella pestis ve Actinomyces bowis bulunduğu taktirde enfeksiyon şüphesi yüksektir. Mantar enfeksiyonu söz konusu ise (özellikle aspergillosis) o zaman balgamda bol miktarda etken olan mantar elemanları görülür. Tuberkülozda 24 saatlik toplam balgam miktarı önemlidir. Petri kutusuna dökülmüş balgam siyah bir zemin üzerine konarak incelenebilir. Kırmızı renk balgamda kan bulunduğunu gösterir. Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonu varsa balgam mavi-yeşil pırıltı taşıyabilir. Bazı pneumoniae lerde de yeşil renkli balgama rastlanır. Zature akciğer kangreni söz konusu ise balgamda met-hemoglobin bulunduğundan renk kirli kahverengidir. Balgamın kokusu anaerob bakterilerden kaynaklanır ve balgam pis kokar. Kıvam bakımından incelenirken balgamın içinde tıkız ve konsantre taneciklerin veya yumakların varlığı araştırılır. Akut akciğer tuberkülozun da mercimek büyüklüğünde sarımsı renkli girintili çıkıntılı peynir gibi gözenekli tanecikler fark edilir. Bu tanecikler içinde bol miktarda mycobacterium tuberculosis bulunur.bronşlara patlamış akciğer apsesi olduğu zaman balgam neredeyse saf cerahat halinde görülür. Mikroskobik incelemede balgamın tanecik veya yumak şekilli yapılarından ezilerek preparat hazırlanır. 3 preparat yeterlidir. 1. Lam-lamel arası canlı mikroskobik muayenesi içindir. Burada mantar elemanları varsa parazit kurtçukları aranır. 2. Gram boyanın aslında gram boyamayla teşhise götürülecek ciddi bilgiler elde etmek zordur. Sadece bakteri sayısı hakkında fikir sahibi oluruz. 3. Ziehl-Neelsen ile boyanır ve balgamda aside dirençli bakteri aranır. Burada aside dirençli bakteri görülmesi demek hastanın balgamında mililitrede 100 bin aside dirençli bakteri var demektir. Bir çok tuberküloz vakasında balgamdan direkt olarak hazırlanan preparatta tuberküloz bakterisi görülmez. Tuberküloz şüphemiz kuvvetli ise balgamı durulaştırmak homojenize etmek ve sonra santrifüj ederek kısaca yoğunlaştırma(teksif) işlemlerinden geçirmemiz gerekir. Bizim preparat için yaptığımız incelemede 3-9 gün aside dirençli bakteri görürsek nadir, bütün preparatta 10 veya biraz daha fazla A.D.B bulmuşsak az, her mikroskop sahasında yaklaşık 10 kadar bakteri görüyorsak bol miktarda A.D.B görüldü diye bilgi verilir. Kültür için balgam iki kanlı jeloza ekilir bunlardan biri aerob diğeri anaerob veya %10 CO2 atmosferde bırakılır. Gerekirse ascitesli buyyona ve tiyoglukatlı buyyona ekim yapılır. Aside dirençli bakterilerde görüldüyse teksif işlemlerinden sonra ortamın pH’sı dengelenir ve alınan örnek Loewenstein-Jensen B.Y’ne ekilir. İnsan tipi tüberküloz mikrobu bu B.Y’de kenarları girintili çıkıntılı güç dağılan yüzeyi pürtüklü krem renkli koloniler meydana getirir. Sığır tipi ise;zaten zor ürer. Küçük düzgün kenarlı, beyazımsı renkli, hafif parlak, bazen şeffaf koloniler yapar.BAKTERİOFAJ: Bakteriler hücrede çoğalarak bakteri hücrelerini lizi eden virüslere, bakteri yiyen anlamında bakteriofaj denir. Sadece DNA veya RNA molekülünden yapılı genomları olan virüsler tipik virüs simetri gruplarına sahiptirler. Bazıları sferik(küresel) simetrili, bazıları helikal simetrili, bazıları karma simetrilidir. Fajlar tipik bir enfeksiyon sonunda bakteriyi parçalayarak serbest kalırlar ve her biri yeni bir bakteriye girerek çoğalmaya devam ederler. Bakteriye girmesinden itibaren, parçalayana kadar meydana getirdiği döl sayısı bilinmediğinden diğer virüslerde de görüldüğü gibi fajların üreme eğrileride basamaklıdır. (basamak yüksekliği eşit). Fajın bir bakteride meydana getirdiği yeni faj sayısına “Batın büyüklüğü” denir. Fajların mikrobiyolojik açıdan bazen büyük faydaları