Enzimler

Kas 30 2007

Enzimler

(0 Oy)

GenBilim Editor

Cumartesi, 01 Aralık 2007

Okunma: 1771 kez

Enzimler, Proteinlerden yapılmışlardır ve doğal olarak yalnız canlılar tarafından sentezlenirler. Hücre içerisinde meydana gelen binlerce tepkimenin hızını ve özgüllüğünü düzenlerler. Çok defa hücre dışında da etkinliklerini korurlar. Solunumun, büyümenin, kas kasılmasının, sinirdeki iletimin, fotosentezin, azot bağlanmasının, deaminasiyonun, sindirim vs.nin temelini oluştururlar. Canlı hücrelerde tepkimeler kural olarak 0-50°C; çoğunlukla da 20-42°C arasında meydana gelir. Bu sıcaklıkta tepkimelerin oluşması biyokatalizör denen enzim ya da fermentlerle olur. Bu, aktivasyon enerjisinin düşürülmesi ile olur.

Başlangıçta "E n z i m" terimi, sindirim kanalında olduğu gibi bir çözelti ya da sıvı içerisinde etki ettiği durumlarda (Kühn 1878); buna karşın "Ferment = Maya" terimi çoğunluk hamur mayasında olduğu gibi, hücreye bağlı olduğu durumlarda kullanılmıştır. Buchner (1897), fermentlerin de hücre dışında etki ettiğini bulunca iki terim arasındaki farklılık ortadan kalkmış oldu. Her iki terim arasında bugün herhangi bir fark olmamakla beraber, bakteri, mantar ve diğer hücreli enzimatik işlevler, mayalanma ve etki maddeleri de ferment olarak kullanılacaktır.

Enzimlerin özellikleri

Yalıtılan enzimlerin tümü protein yapısındadır ya da protein kısmı bulundururlar. Etki ettiği maddenin sonuna "Ase = Az" eki getirilerek ya da katalizlediği tepkimenin çeşidine göre adlandırılırlar. Örneğin, kitine etki eden kitinaz enzimi vs. Çok defa renksizdirler, bazen sarı, yeşil, mavi, kahverengi ya da kırmızı olabilirler. Suda ya da sulandırılmış tuz çözeltisinde çözülebilirler. Fakat mitokondrilerde bulunan enzimler lipoproteinler ile bağlandığından (bir fosfolipit-protein kompleksi) suda çözünmez. Enzimlerin etkinlikleri akıllara durgunluk verecek derecededir; örneğin, sığır karaciğerinden elde edilen ve bir molekül demir içeren katalaz enzimi, bir dakikada, O C°'de 5.000.000 hidrojen peroksit (H2Cy molekülünü H2O ve 1 /2 O2'ye parçalayabilir. Enzimin etki ettiği bileşiğe "Substrat" denir; bu durumda hidrojen peroksit katalazın substratıdır. Enzimin saniyede etki ettiği substrat molekül sayışma Enzimin Etkinlik Değeri = Turnover Sayışı denir. Bu O C°'de katalaz enzimi için 5.000.000 dür. Bazı enzimler tepkimelerde yan ürün olarak vücutta H2O2 meydana getirdiğinden ve bu da vücut için zehirli olduğundan, katalaz enzimi onları sürekli parçalayarak hücreleri korur. Bir molekül katalaz enziminin parçaladığı H2O2'i demir atomu yalnız başına ancak 300 senede parçalayabilir. Ya da mol başına aktivasyon enerjisi için 18.000 kalori vermek gerekir. Kolloyidal platin bu aktivasyon enerjisini 11.700 Kal./Mol.'a, katalaz enzimi de 5500 Kal./Mol.'a düşürür. Bazı enzimler çok özgüldür; yalnız bir substrata etki eder. örneğin, üreaz yalnız üreye etki ederek onu amonyak ve CO2'de parçalar. Halbuki bazıları çeşitli substratlara etki eder; dolayısıyla daha az özgüldürler, örneğin peroksidaz başta hidrojen peroksit olmak üzere birçok bileşiğe etki eder. Bazı enzimler yalnız bazı bağlar için özgüldür, örneğin pankreastan salgılanan lipaz, yağlardaki ester bağlarına etki eder.

Kuramsal olarak enzimli tepkimeler dönüşlüdür; enzim, tepkimenin yönünü değil dengenin oranım saptar. Tipik örnek, lipazın yağı parçalaması; fakat aynı zamanda gliserin ile yağ asitlerini birleştirmesidir. Ortamda sadece yağ asidi ya da sadece gliserin ile yağ asitlerinin birleşimi varsa denge ona göre,
Yağ -------> gliserin + 3 yağ asidi şeklinde olur. Denge noktası, yani tepkimenin hangi yöne gideceği termodinamik yasalarına göre belirlenir. Çünkü denge bir tarata doğru giderken enerji verir, tersine enerji alır.

Enerjiye gereksinim gösteren tepkimelerin, enerji meydana getiren tepkimelerle aynı zamanda meydana gelmesi gerekir ya da enerji herhangi bir şekilde önceden depo edilmelidir. Canlı bünyesinde enerji depo etme, fosfor esterleri şeklinde olur. Yaşamsal işlevlerin yürütülmesinde ATP (adenozin trifosfat) en önemlilerindendir; bu bileşik batarya gibi görev yapar.
Enzimler hücrede bir takım 'team' halinde çalışır; birinin son ürünü kendisinden sonraki enzimin substratını yapar, örneğin, amilaz enzimi nişastayı iki zincirli maltoza, maltaz enzimi ise maltozu tek zincirli glikoza çevirir. Bir seri enzim aracılığıyla (11 kadar), daha sonra göreceğimiz gibi, glikoz da laktik aside çevrilir vs.

Enzimlerin Yapısı

Tüm enzim proteinleri genler tarafından şifrelenir. Dolayısıyla amino asit dizilimi kendine özgüdür (bir gen-bir enzim kuralını hatırlayınız). Bazı enzimler (pepsin ve üreaz gibi) yalnız proteinden oluşmuştur. Fakat diğer çoğunluğu iki farklı kısımdan meydana gelmiştir. Bunlar:
a) Protein Kısmı (enzimin apoenzim kısmı): Bu kısım enzimin hangi maddeye etki edeceğini saptar.

b) Koenzîm Kısmı: Organik ya da inorganik, çok defa fosfattan meydana gelmiş, protein kısmına göre çok daha küçük moleküllü bir kısmıdır. Enzimde işlev gören ve esas iş yapan kısım bu kısımdır. Koenzim kısmı genellikle protein kısmından ayrılabilir ve analizlerinde birçok vitamini bünyesinde bulundurduğu (thiamin, niacin, riboflavin vs.) görülmüştür. Buradan şu genelleştirmeyi yapabiliriz: Bütün vitaminler hücrede enzimlerin koenzim kısmı olarak ödev görürler. Ne koenzim ne de apoenzim kısmı yalnız başına etkindir. Bazı enzimler ortama yalnız belirli iyonlar eklendiğinde etkindirler, örneğin bazı enzim zincirine ancak Mg++ iyonu eklenince glikozu laktik aside çevirebilir. Tükürükteki amilaz nişastayı yalnız Cl iyonlarının bulunduğu ortamda parçalayabilir. Canlı bünyesinde bulunan eser elementler, Mn, Cu, Zn, Fe ve diğer elementler bu enzimatik işlevlerde aktivatör olarak kullanılır. Bazen enzimin iş görebilmesi için bir metal iyonuna gereksinim vardır. Yani koenzim kısmı metal iyonu ise (Ca++, K++ Mg+, Zn++) buna "Kofaktör" denir. Enzimin etkinlik göstermesi için gereksinme duyduğu organik moleküllere "K o e n z i m" denir. Bazı durumlarda koenzim kısmı apoenzim kısmına kuvvetlice (kovalent) bağlanmıştır; bu sıkı bağlanan kısma "Prostetik Grup"; prostetik grupla apoenzim kısmının her ikisine birden de "Holoenzim" denir. Koenzimlerden önemli olanların bazılarını hücre metabolizmasında göreceğiz.

Enzimlerin bir kısmı sitoplazmaya serbestçe dağılmış olarak, diğer bir kısmı da hücredeki bazı yapılara sıkıca bağlanmış olarak bulunur. Laktik asit, amino asit ve yağ asitlerinden türeyen maddeleri karbondioksit ve suya kadar parçalayan solunum enzimleri, mitokondri zarlarının yapışma katılır. Keza ribozomların işlevsel bütünlüğüne katılan enzimler de bu tiptir. Dokulardaki enzimler değişik yöntemlerle saptanabilir.

Enzimlerin Sınıflandırılması

Her enzimin 4 rakamlı bir numarası vardır, örneğin, 3.6.1.3. "ATP fosfohidrolaz" da birinci numara sınıfını, ikinci numara alt sınıfını, üçüncü numara grubunu, dördüncü numara da kendine özgü sıra numarasını) verir.
Buna göre enzim sınıfları şunlardır:

1. Oksidoredüktazlar: Redoks tepkimelerini katalizler.
a) Dehidrogenazlar: elektron kazandırıcı tepkimeleri etkilerler.
b) Oksidazlar: Elektron kaybeden tepkimeleri etkilerler.
c) Redüktazlar: Substratı bir redüktör aracılığıyla indirgeyen enzimlere denir. örneğin asetaldehit redüktaz, asetaldehiti alkole redükler.
d) Transhidrogenazlar: Bir molekülden diğerine hidrojen taşıyarak onu redüklerler.
e)Hidroksilazlar: Substratlarına bir hidroksil ya da su molekülü katan enzimlere denir, örneğin, fenilalanin hidroksilaz bir hidroksil grubunu fenilalanine ekleyerek onu tirozine dönüştürür.
Transferaz Enzimler: Hidrojenin dışında bir atomun veya atom grubunun (metil, karboksil, glikozil, amino, fosfat grupları) bir molekülden diğerine aktarılmasını sağlarlar.
Dekarboksilazlar: Karboksilik asitlerden CO2 çıkmasını sağlarlar.
3. Hidrolaz Enzimler: Bir molekül su sokmak suretiyle ya da su molekülü aracılığıyla moleküllerin yıkılmasını sağlayan enzimlerdir. Ester, peptit, asitanhidrit ve glikozidik bağlarına etki ederler.
a) Esterazlar: Ester bağım yıkan enzimlerdir (lipaz, ribonükleaz, fosfataz, pirofosfataz, glikozidaz).
b) Proteazlar: Peptit bağım yıkan enzimlerdir (proteinaz).
4. Liazlar: Su molekülü çıkarmadan molekülleri yıkan enzimlerdir, örneğin C-C bağı, aldolaz ve dekarboksilazla yıkılır. Keza C-0 ve C-N bağım yıkanlar da vardır.
5. izomerazlar: Molekül içinde değişiklik yaparak onun uzayda dizilişin! değiştiren enzimlerdir. Örneğin razemaz, epimeraz.
6. Ligazlar (= Sentetazlar): Enerji kullanarak substrat moleküllerinin birbirine bağlanmasını; örneğin amino asitlerin ve yağ asitlerinin aktifleşmesini sağlarlar.

Enzimlerin Çalışma Mekanizması

Daha önce de değindiğimiz gibi enzimin hangi substratla çalışılacağını saptayan kısmı apoenzim kısmıdır. Demek ki apoenzim kısmıyla substrat arasında bir ilişki vardır. Alman kimyacısı EMIL FISCHER tarafından bunun kilit anahtar uyumu gibi olacağı savunulmuştur. Koenzim kısmı daha çok kimyasal bağa yakın olarak işlev gösterir, örneğin ester bağlarını parçalar vs. öyle anlaşılıyor ki enzimin apoenzim kısmı bir ya da birkaç yerinden (aktif bölgelerden) substrat molekülüne yapışıyor ya da bağlanıyor (yani bir enzim-substrat kompleksi oluşturuyor) ve bu arada koenzim kısmı substrat üzerindeki bağlarla gerçek anlamda birleşmeye veya bağlanmaya giderek onu parçalıyor. Elinde kazması olan bir yol işçisi, kazacağı yeri kendisi saptamasına karşın (apoenzim kısmı), kazma işlemini yapan kazmanın kendisidir (koenzim kısmı). Enzimlerde kural aynıdır. Enzimlerin kimyasal yapıları, özellikle üçüncül yapıları tam olarak bilinmediğinden (ilk yapışı açıklanan enzim ribonükleaz, 124 amino asitten meydana gelmiştir) çalışma mekanizmaları da hala tam anlamıyla açıklığa kavuşturulamamıştır.

Enzimlerin Çalışmasına Etki Eden Faktörler : Sıcaklık

Sıcaklık 10 °C yükseldiğinde tepkime hızı iki misli artar; yani tepkime hızının yükselmesi, sıcaklıkla doğru orantılıdır. Fakat belirli bir noktadan itibaren düşmeye başlar ve tamamen durur. En iyi çalışabileceği sıcaklığa Optimum Sıcaklık denir. Yüksek sıcaklıklarda enzimler etkisizdirler (genellikle 55-60 °C'de). Bazı ılıcalarda yosunlar 80 °C'de yaşabilirler; fakat bunun üzerindeki sıcaklıklarda enzimleri tamamen koagüle olur ve bir daha etkili hale geçemez. Optimum noktanın biraz üzerinde enzimler etkisiz olmasına karşın, sıcaklık düşünce tekrar etkili hale geçebilirler. Fakat bu sıcaklığın devamı ya da sıcaklığın biraz daha yükselmesi enzimlerin etkinliğini sonsuz olarak ortadan kaldırır. Enzimlerin etkisiz hale geçmeleri ile proteinlerin koagüle olması arasında büyük bir ilişkinin olması, onların, büyük bir kısminin proteinlerden yapıldığım kanıtlar. Doğal olarak enzimler, proteinlerin bir kısmı gibi üçüncül yapıya sahiptir veya en azından moleküllerinin bir kısmı bu yapıdadır. Fakat yüksek sıcaklıklarda bu helozonik ya da üçüncül yapı parçalandığından ya da birbiri üzerine yığıldığından, protein koagüle olur ve enzim etkisiz hale geçer (sütün kaynatılmasında, bakteri enzimlerinin etkisiz hale geçmesi ile ekşime önlenir; bu yoldan teknikte büyük ölçüde yararlanılır; konserve vs. yapımında). Düşük sıcaklıklar enzimin etkinliğini azaltır. 0°C'de enzim ya hiç ya da pek az işlev gösterir; fakat soğuğun enzimin yapışım bozduğu görülmemiştir. Sıcaklık eski hale döndüğünde etkinlik yine başlar (dondurmak suretiyle besin maddelerinin saklanması, yine enzimlerin etkisiz hale geçirilmesiyle sağlanır), insan vücudunda, daha doğrusu sabit sıcaklıklı hayvanlardaki enzimler çoğunluk 37°C'de optimum etkindirler. Daha yüksek sıcaklıklarda (çocuklarda 42, yetişkinlerde 41 °C) enzimler etkisizleşirler; çok defa da koagüle olurlar.

pH

Enzimler pH değişimine karşı çok duyarlıdırlar. Genellikle çok fazla asidik ve alkalik ortamda etkisizdirler. Bazı hallerde enzimler en yüksek etkinliği belirli bir pH derecesinde gösterirler. Bu pH derecesine "Optimum pH" denir. Örneğin, proteini parçalayan pepsin, midenin 2 pH'lık asidik ortamında maksimum çalışır; buna zıt olarak pankreastan salgılanan ve yine protein sindiriminde rol alan tripsin, ancak 8,5 pH'de optimum olarak çalışabilir. pH'la ilgili olmasının nedeni, yapılarında proteinleri taşımalarındandır. Ola ki, pH'a bağlı olarak protein molekülü üzerinde çeşitli elektrik yüklenmeleri ve buna bağlı olarak dış yüz şekli (üçüncül yapı) meydana gelmekte ve substratla-enzim uyuşmasını sağlamaktadır. Belki de bu elektrik yüklenmesi enzim-substrat arasındaki çekiciliği artırmaktadır. Kuvvetli asitler ve bazlar enzimleri koagüle ederler.

Enzim /Substrat Derişimi

Eğer pH ve sıcaklık sabit tutulursa, enzim/substrat derişimi arasındaki orana bağlı olarak bir tepkime hızı görülür. Substratın ya da enzimin fazla olması bu hızı değişik şekillerde etkileyebilir. Bol substrat bulunan bir ortama eklenecek enzim, son ürünün miktarım artıracaktır.
Diğer Kimyasal Maddeler ve Suyun Etkisi
Birçok kimyasal madde enzimleri etkisiz hale getirir; örneğin, siyanit, solunumda önemli rol oynayan sitokrom oksidaz enzimin! etkileyerek inhibe eder (Şekil 2.15/c). Ölüm meydana gelebilir. Florit, glikozu laktik aside çeviren enzim kademelerine etki eder. Hatta enzimin bizzat kendisi zehir etkisi yapabilir; örneğin, 1 mg. kristal tripsin, farenin damarına enjekte edilirse ölüm meydana gelir. Bazı yılan, arı ve akrep zehirleri de enzimatik etki göstererek kan hücrelerin! ya da diğer dokuları tahrip ederler.
Enzimlerin büyük bir kısmı işlevlerini su içerisinde gösterdiklerinden, suyun miktarı da enzim işlevinde etken bir koşuldur. Genellikle % 15'in altında su içeren ortamlarda, enzimler işlev göstermezler. Reçel ve pekmez yapımında bu faktör önemlidir. Sulandırılan reçelin, balın ya da pekmezin vs.nin mayalanması ve ekşimesi bu yüzdendir. Hatta tahıl alımlarında su oranının % 15'in altında istenmesi de bu nedene dayanır.

Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz enzim eksikliği gözlenen olgularda eritrosit zarı Na+-K+/Mg++ adenozin 5'-trifosfataz, eritrosit süperoksit dismutaz ve plazma malondialdehit düzeyleri

ÖZET: Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz (G6PD) enzimi, pentoz fosfat yolunun ilk ve düzenleyici anahtar enzimi olup reaksiyon neticesinde oluşan NADPH, sülfidril gruplarının korunmasında, serbest radikallerin ve peroksitlerin detoksifikasyonununda rol alır. G6PD enzim eksikliği Çukurova Bölgesinde %8.2 olarak bulunmuştur. Serbest radikaller, membran lipidlerinin ve de proteinlerin irreversibil zararından direkt sorumludur. Bu amaçla G6PD enzim eksikliğinde gözlenen hemoliz olayının fizyopatolojisine açıklık getirmek amacıyla G6PD enzim eksikliği saptanan 8 olgunun eritrosit membran enzimlerinden olan Na+-K+/Mg++ adenozin 5'-trifosfataz (Na+-K+/Mg++ ATPaz), ile süperoksit dismutaz (SOD) ve hasarın göstergesi olarak da plazma malondialdehit (MDA) düzeyleri çalışılmıştır. Na+-K+/Mg++ ATPaz enzim aktivitesi kontrol grubunda 299±18 nmol Pi/mg protein/saat iken G6PD enzim eksikliği olan grubda 217±14 nmol Pi/mg protein/saat olarak saptanmıştır (p<0.001). SOD enzim aktivitesi kontrol ve G6PD enzim eksikliği olan grupda sırasıyla 1275±237, 646±227 U/gr Hb olarak bulunmuştur (P<0.001). MDA düzeyleri ise kontrol grubunda 1.7±1.5 nmol/ml iken, G6PD enzim eksikliği olan grupda 4.4±0.5 nmol/ml olarak bulunmuştur (p<0.001). G6PD enzim eksikliği gözlenen olgularda hasarın göstergesi olan MDA düzeyleri artarken, Na+-K+/Mg++ ATPaz ve SOD enzim düzeyleri kontrol grubuna oranla istatiksel açıdan anlamlı derecede düşük bulunmuştur.

GİRİŞ
Enzim eksiklikleri içinde en yüksek insidansı gösterdiği bilinen Glukoz-6-Fosfat Dehidrogenaz (G6PD; D-Glukoz-6-Fosfat: NADP+ Oksidoredüktaz, ECI.1.1.49) enziminin, yeryüzünde 400 milyondan fazla insanı etkilediği rapor edilmiştir.4,7,24 G6PD enzim eksikliği Türkiye genelinde %0.6.24 Eti Türklerinde %11.4, 4,24 Çukurova Bölgesinde ise %8.2 olarak rapor edilmiştir.27 Enzim X kromozomu üzerinde bulunan gen tarafından şifrelendiği için X'e bağlı geçiş göstermektedir.8

Eritrositlerde, glukozun %10'u heksoz Mono Fosfat (HMP) yoluna girmektedir. Enzim, Glukoz-6-Fosfatın, 6-fosfoglukanolaktona dönüşümünü kataliz ederken Nikotinamid adenin Dinükleotid Fosfat (NADP)'ın redükte hale geçmesini sağlamaktadır. Oluşan redükte NADP'ler de bir çok biyokimyasal olayın düzenlenmesinde ve hücreye redükte glutatyon (GSH) temininde kullanılmaktadır. G6PD enzim eksikliği durumunda, redükte glutatyon üretimi azalacağından, hücre kendisini oksidatif hasara karşı koruyamayacak ve hemolitik anemi tablosu gelişecektir.5
Herhangi bir travmaya maruz kalan dokular, immunolojik olan veya olmayan bir etkene karşı, fagositik hücrelerle korunmaya çalışırlar. Fagositik hücrelerin en fazla çalışanları, nötrofiller, doku makrofajları ve monositlerdir.13 Nötrofillerin ve makrofajların aktivasyonu, respiratuar bir patlamayla sonuçlanır. Bu da HMP yolu üzerinde glukoz metabolizmasını ve oksijen tüketimini 2-20 kat artırır. Oksijen tüketimindeki artışla birlikte nötrofillerin ve makrofajların süperoksit anyonu (O--2), ile hidrojen perosit (H2O2) salgıladıkları gösterilmiştir.23

Serbest radikaller membran lipid ve proteinlerinin irreversibil şekilde hasara uğramasından sorumludur. Serbest radikallerin protein metabolizmasına etkisi genellikle sülfhidril grupları üzerinedir. Serbest radikallerin etkisinde kalan sülfhidril grupları -S-S- şekline dönüşür. Reaktif oksijen türleri, kolayca membran lipidlerini etkileyerek doymamış aldehidlerin oluşmasına neden olmaktadır. Bunlar serbest radikallerden daha dayanıklı olup, direkt hücredeki biyomoleküllerin yapısını bozarak proteinlerin ve diğer moleküllerin modifikasyonuna ve lipid peroksidasyonuna neden olmaktadır. Dolayısıyla doymamış aldehidler eritrositlerin hemolizine ve protein sentezinin inhibisyonuna neden olmaktadır.10,17

Serbest radikallerin bu zararlı etkilerine karşı hücrede bir çok antioksidan savunma sistemi bulunmaktadır. Savunma sisteminde görev alan SOD enzimi ise 2 molekül süperoksit anyonunu hidrojen peroksite dönüştürmektedir.9

Bu amaçla G6PD enzim eksikliğinde gözlenen hemoliz olayının fizyopatolojisine açıklık getirmek amacı ile, G6PD enzim eksikliği gözlenen olguların (Yaş ortalaması:23±9;G6PD enzim düzeyi.0-4 U/gr Hb) eritrosit membran enzimlerinden olan Na+-K+/Mg++ Adenozin 5'-trifosfataz (Na+-K+/Mg++ ATPaz) ile süperoksit dismutaz (SOD) enzim düzeyleri ve oluşan hasarın göstergesi olarak da plazma malondialdehit (MDA) düzeyleri saptanmaya çalışılmıştır.

MATERYAL ve METOD
Na+-K+/Mg++ ATPaz ENZİM AKTİVİTESİNİN ÖLÇÜMÜ: Eritrosit zarının hazırlanmasında Beutler'in yöntemi kullanılmıştır. Eritrositler izotonik ortamda yıkanarak osmotik şok yoluyla hemoliz edildikten sonra yüksek hızda santrifüj edilerek hemoglobin ortamdan uzaklaştırılmıştır.6
İnkübasyon ortamı Reading ve arkadaşlarının önerdikleri yönteme göre hazırlanmıştır.21,22 İnkübasyon ortamına eklenen ATP'den açığa çıkan inorganik fosfat ölçümü Ames tarafından önerilen yönteme göre çalışılmıştır. Yöntem, ATP'den ayrışan inorganik fosfatın fosfomolibdat ile kompleks oluşturması prensibine dayanmaktadır.2

PROTEİN ÖLÇÜMÜ: Lowry ve arkadaşlarının geliştirdikleri yönteme göre ölçülmüştür.16

PLAZMA MALONDİALDEHİT ÖLÇÜMÜ: Malondialdehit ölçümü lipid peroksidasyonu sonucu oluşan malondialdehitin (MDA) thiobarbitürik asit (TBA) ile oluşturdukları pembe rengin 532 nm'deki absorbans şiddetinin ölçülmesi prensibine dayanmaktadır.11

ERİTROSİT G6PD VE SOD ENZİM AKTİVİTESİNİN ÖLÇÜMÜ: Eritrosit içi SOD enzim aktivitesi Randox kit yöntemine göre çalışılmış ve enzim aktivitesi U/gr Hb olarak verilmiştir. Bu yöntemin prensibi Ksantin oksidaz kullanmak sureti ile ksantinden süperoksit radikalleri oluşturularak bu radikallerin 2-(4 iyodofenil)-3-(4 nitrofenol)-5 fenil tetrazolium klorid (INT) ile kırmızı bir formazon boyası oluşturması esasına dayanmaktadır. Daha sonra SOD aktivitesi bu reaksiyonun inhibisyon derecesi ile ölçülmektedir (Randox laboratories, Ardmore, U.K.). Eritrosit G6PD enzim aktivitesi ise Beutler yöntemine göre spektrofotometrik olarak ölçülmüştür.4

İSTATİKSEL YÖNTEMLER: Gruplara ait ortalama±standart sapma (X±SD) değerleri ve gruplar arasındaki farkın önem kontrolü student-t-testiyle yapılmıştır.25

BULGULAR
Tablo-1 'de gözlendiği gibi kontrol grubunda Na+-K+/Mg++ ATPaz enzim aktivitesi 299±18 nmol Pi/mg protein/saat iken G6PD enzim eksikliği gözlenen grubda 217±14 nmol Pi/mg protein/saat olarak saptanmıştır (p<0.001). SOD enzim aktivitesi kontrol ve G6PD enzim eksikliği gözlenen grupda sırası ile 1275±237, 646±227 U/gr Hb olarak bulunmuştur (p<0.001). MDA düzeyleri ise kontrol grubunda 1.7±1.5 nmol/ml iken, G6PD enzim eksikliği gözlenen grupda 4.4±0.5 nmol/ml olarak saptanmıştır (p<0.001).
Tablo 1 :Kontrol ve G6PD Enzim Eksikliği Gözlenen Gruplara ait Na+-K+/Mg++, SOD ve MDA düzeyleri.
   Na+-K+/Mg++ ATP az
nmol Pi/mg protein/saat   SOD
U/gr Hb   MDA
nmol/ml
G6PD
Eksikliği
n=8   217±14   646±227   4.4±0.5
Kontrol
n=10   299±18   1275±237   1.7±1.5
p   p<0.001   p<0.001   p<0.001
Tablodaki değerler Ortalama±standart sapma (X±SD) olarak verilmiştir.
n: Denek Sayısı. p: Gruplar arasındaki farkın önem kontrolü.

TARTIŞMA
G6PD enzimi tüm dokularda bulunmasına rağmen, eksikliğin en fazla eritrositlerde gözlendiği ve bu eksikliğin dünyada en yaygın enzim eksikliği olduğu bildirilmiştir.7,14,15
G6PD enzim aktivitesini, alınan besinlerin kalite ve kantitesi, hormonlar ve NADPH düzeyi etkilemektedir. Enzimin kataliz ettiği reaksiyon neticesinde oluşan redükte NADP'ler sülfhidril gruplarının korunmasında, serbest radikallerin ve peroksitlerin detoksifikasyonunda, yağ asidi sentezi gibi bir çok biyosentetik reaksiyonda kullanılmaktadır.18
Okside glutatyonun hücre içi redüksiyonunu kataliz eden Glutatyon Redüktaz enziminin koenzimi olan NADPH 'lar, G6PD enzimi eksik olgularda yeterince üretilmeyeceği için eritrositler oksidatif strese karşı korunamayarak 120 günden önce yıkılacaktır.3,5 Enzim eksikliği olan olgularda O2 tüketiminin ve serbest radikal üretiminin arttığı bilinmektedir. Artan serbest radikal üretiminin, metHb oluşumuna sebep olacağı ve antioksidan mekanizmanın, oluşan metHb 'ni dolaşımdan temizleyemeyeceği rapor edilmiştir. Hemoglobinin oksidasyonu ile oluşan süperoksit anyonları enzim eksikliği nedeniyle yeteri kadar üretilemeyen NADPH eksikliğine bağlı olarak uzaklaştırılamayacak ve yetersiz GSH nedeniyle, glutatyon peroksidaz işlevini tam göremeyecektir.3,5,7,12

Bu çalışmadaki bulgulara göre G6PD enzim eksikliği gözlenen olgularda plazma MDA düzeyi %61 artarken, eritrosit SOD enzim aktivitesi %49 oranında azalmaktadır.
Fizyolojik koşullarda, serbest radikal üretiminin bir çok zararlı etkisine karşı bir çok antioksidan sistemde koruyucu olarak görev almaktadır. Lipid peroksidasyonu sonucu ortaya çıkan hücre hasarının derecesi hücre içindeki bu antioksidan savunma sistemlerinin yetersizliği oranında büyük olacaktır. Bu savunma sistemlerini serbest radikal tutucuları ve bazı enzimler oluşturmaktadır. Savunma işlevinde öncelikle enzimatik sistemler rol almaktadır.19,20
Topçu ve arkadaşları yaptıkları çalışmada G6PD enzim eksikliği gözlenen olgularda eritrosit zarı Na+-K+/Mg++ ATPaz ve Ca++/Mg++ ATPaz enzim düzeyinde normale göre farklılık gözlememişledir.26 Akoğlu ve arkadaşları da G6PD enzim eksikliği gözlenen olgularda Na+-K+/Mg++ ATPaz enzim aktivitesinde farklılık gözlememişlerdir1.

Fakat bu çalışmada Na+-K+/Mg++ enzim düzeyi G6PD enzim eksikliği olan olgularda normale göre %27 azalmış olarak bulunmuştur. Çünkü serbest radikaller direkt veya indirekt yolla lipid peroksidasyonuna neden olmakta ve bu da zar yapısını bozmaktadır. Na+-K+/Mg++ ATPaz enzim sistemi zar lipid çift tabakasına lokalize olmuştur. Oluşan harabiyet Na+-K+/Mg++ ATPaz enzim sisteminide etkilemektedir. Ayrıca bu çalışmada lipid peroksidasyonunun göstergesi olan MDA düzeyinde G6PD enzimi eksik olan olgularda %61 oranında artma ve serbest radikallerin ortadan kaldırılmasında görev alan SOD enzim düzeyinde ise %49 oranında azalma gözlenmiştir.

Sonuç olarak G6PD enzim eksikliğinde gözlenen hemolizin kaynağı olarak Na+-K+/Mg++ ATPaz enzim aktivitesinin azalması ve bunun sonucu olarakta Na+ ve K+ iyonlarının hücre içi ve dışı derişimlerinin değişmesine bağlı olabileceği düşünülmektedir. Zar lipid çift tabakasında lokalize olan fosfolipidlerin Na+-K+/Mg++ ATPaz enzim aktivitesi için gerekli olduğu, ancak lipid peroksidasyon ürünlerinin zar yapısını bozmasından dolayı Na+-K+/Mg++ ATPaz enzim sisteminin inhibe olduğu düşünülmüştür.

Dr.Lülüfer TAMER,
Dr.Birsel ÜNAL,
Dr.Kıymet AKSOY
Dr.Lülüfer TAMER

KAYNAKLAR
1.   Akoğlu T, Özdoğu R, Erdoğan H, Özer FL : Erythrocytemembrane ATPase activity of G6PD-deficient individuals and the effect of primaquine metabolic on membrane ATPase systems. Trop Med Hys. 1984; 87: 219-224.
2.   Ames BN : Assay of inorganic phosphate methods in enzimology. New York. Academic Press. 1966.
3.   Arese P, De flora A : Pathophysiology of hemolysis in Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. Semin Hematol. 27: 1-40. 1990.
4.   Beutler E : Red cell metabolism. A mannuel of biochemistry Grune and Stratton, New York. 1975.
5.   Beutler E : Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. Hemolytic anemia in disorders of red cell metabolism, in Hematology. Plenum, New York, 1978.
6.   Beutler E, Kuhl W, Sachs P. : Sodium-potassium ATP 'ase activity in influenced by ethnic origin and not by obesity. N Eng J Med. 1983; 309:756.
7.   Beutler E. : Glucose-6-Phosphate dehydregenase deficiency. Eng J Med. 1991; 324: 169-173.
8.   Deleon PA, Wolf SF, Persico G. : Localization of glucose-6-phosphate dehydrogenase in mouse and man by in situ hybridization; evidence for a single locus and transposition of homologous X-linked genes. Cytogenel Cell Genet. 1985: 35: 87-92.
9.   Gutteridge JMC : Lipid peroxidation and antioxidant as biomarkers of tissue damage. Clin Chem. 1995; 12: 1819-1828.
10.   Hallwell B, Gutteredgi J : The important of free radicals and catalytic metal ions in human disease. Mol Aspect Med. 1985; 8: 89-91.
11.   Hiroshi O, Nabuko O, Yagi K : Assay for lipid peroxidation in animal tissues by thiobarbitüric acid reaction. Anal Biochem. 1979; 95: 351-358.
12.   Janney SK, Joist SH, Fithch CD : Excess release of ferriheme in G6PD deficience erythrocytes possible cause of hemolysis and resistance to malaria. Blood. 1986; 67: 331-333.
13.   Joseph C, Peter A: Role of oxygen-derived free radicals and metabolism in leukocyte-dependent inflammatory reactions. Am Assoc Pathol. 1982; 107: 263-303.
14.   Kletzien R, Harris P, Foellm L : Glucose-6-phosphate dehydrogenese : "housekeeping enzyme subject to tissue-spesific regulation by hormones nutrient and oxident stress. Fasel J. 1984; 8: 174-181.
15.   Levy R : Glucose-6-phosphate dehydrogenese. Adv. Enzymol. 1979; 48: 97-192.
16.   Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL et al. : Protein measurement with folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951; 193:261.
17.   Lynch L, Fridovich I : Effect of superoxide on the erythrocyte membranes. J Biol Chem. 1978: 253: 1138-1845.
18.   Murray R, Granner D, Maye P, Rodwell V: Harper 's Biochemistry. Appleton Lange. East Norwalk. 1993.
19.   Niki E : Antioxidant compounds. Free Radic. 190; 9:9.
20.   Oberley LW : Free radicals and diabetes. Free Radic Biol Med. 1988; 5: 113-124.
21.   Reading HW, İsbir T: Action of lithium on ATP 'ase in transmitter release from rat iris. Biochem Pharmacol. 1979; 28: 3441.
22.   Reading HW, İsbir T: The role of cation-activated ATP 'ase in transmitter release from rat iris. J Exper Phsiol. 1980; 65:105.
23.   Reslinski J, Hoey J, Simith W, et al.: Celluler response to oxidative stress at sulfhidryl group receptor sites on the erytrocyte membrane. J Biol Chem. 1988; 263: 12360- 12366.
24.   Say S, Özand P, Berkel i: Erytrocyte glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency in Turkey. Acta Paediat Scand.1965; 54: 320-325.
25.   Sounder BD, Trapp RG: Basic and clinical bioistatistics Prentice-Itali International Inc. London. 1994.
26.   Topçu Z: Bakla ekstrelerinin eritrosit glutatyon düzeyleri ve ATPaz enzim sistemlerine etkisi. Master tezi. Adana, 1985.
27.   Yüreğir G.T. İsbir T: Çukurova 'da HbS ve G6PD enzim eksikliği ve aralarındaki ilişki. Doğa Tıp Ecz. 1984; 8:232-244.