Elektoforetik metotlar
Elektroforez; çözeltideki iyonların elektrik
akımının tesiri ile meydana gelen hareketlerini
tanımlamak için kullanılan bir terimdir. Elektriksel alan
içerisindeki göç; elektrik akımının şiddetine, net yüke,
molekülün şekline, solüsyonun iyonik gücüne,
viskozitesine ve sıcaklığına bağlıdır. Göç hızı, protein
molekülü üzerindeki yükün büyüklüğü ile doğru
orantılıdır. İyonik bileşiklerin iyonlaşması, elektorforezin
temelini oluşturur. Zıt yükteki elektrotlara doğru farklı
hızlarda hareket eden değişik yükteki iyonlar elektriksel
alanda birbirinden ayrılırlar. Elektroforez, ayrılması
istenen iyonları ihtiva eden bir çözelti ile kağıt, nişasta
agar, selüloz asetat zarı gibi inert bir taşıyıcı materyalin
teşkil ettiği bir sistemde de yapılabilir (2, 12, 16). Protein
üzerindeki yüklerin birbirini dengelediği pH’ya o
proteinin izoelektrik noktası (p1) adı verilir. Bu pH’da
proteinler hem anod, hem katotdan aynı kuvvetle
çekildikleri için proteinlerin bu pH’daki hareketleri sıfır
olur (17, 18).
Elektroforez çeşitleri
Kullanılan ayırma ortamının cinsine göre çeşitli
elektroforez teknikleri kullanılmaktadır. Kağıt
elektroforezi, selüloz asetat elektroforezi, agar jel
elektroforezi, nişasta jel elektroforezi, poliakrilamid
elektroforezi ve SDS-poliakrilamid jel elektroforezi
bunlar arasında sayılmaktadır (25, 28, 43, 44).
Poliakrilamid jel
Poliakrilamidin bir bağlayıcı (genellikle bis
akrilamid) ile (polimerize edilmesi sonucu oluşturulur.
Böylece rasgele büyüyen poliakrilamid ve bis akrilamid
konsantrasyonları oluşacak jelin yoğunluğunu,
viskozitesini, elastikiyetini ve mekanik dağınıklığını
belirler. Bu konsantrasyonların arttırılmasıyla oluşan ağın
sıklığı da artmakta, buna bağlı olarak gözenek çapı
azalmaktadır. Böylece içinden yürüyecek
makromoleküllerin hareketi, büyüklüklerine (molekül
ağırlıklarına) göre sınırlandırılmış olmaktadır. Akrilamid
ve bis için genellikle kullanılan konsantrasyonlar,
incelenecek olan makromoleküllerin büyüklüğüne göre
akrilamid miktarının bis miktarına oranı 10-100 arasında
ve akrilamid konsantrasyonu % 5’den büyük olur.
Akrilamidin bis vasıtasıyla polimerizasyonunu
katalizlemek amacıyla amonyum per sulfat (APS) ve
tetrametiletilendiamin (TEMED) kullanılmaktadır (43,
44).
Polyakrilamid jel izoelektrik odaklama
yönteminin prensibi
İzoelektrik odaklama, bir pH gradiyetinde yapılan
elektroforezdir. Bunun için makromoleküller (+) ve (-)
yüklere sahip oldukları müddetçe gradient boyunca
izoelektrik noktalarına rastlayan pH’ya kadar göç ederler.
İzoelektrik noktada net elektriksel yük sıfırdır. pH
gradienti düşük molekül ağırlıklı amfoterik maddelerin
(amfolitler) yardımıyla oluşturulur. Eğer elektroforezde
kullanılan tampon sistemi yerine anotta kuvvetli bir asit,
katotta da kuvvetli bir baz kullanılır ve aradaki jel
ortamına da gerektiği kadar amfolit solusyonu katılırsa
amfolitlerin anoda yakın kısmında (+) katoda yakın
kısımda (-) net yükleri olur. Bundan dolayı elektrik
verildiğinde bunlar anot ve katot tarafına itilerek merkeze
doğru hareket ederler. Bu hareketleri sırasında çevresel
ortamın pH’sının kendi izoelektrik noktalarına eşit olduğu
bölgelerde hareketsiz kalırlar. Bundan dolayı, en asidik
amfolitler katoda yakın olacak şekilde izoelektrik
noktalarına göre sıralanırlar. Bunun sonucu jel içinde
103
YYÜ Vet Fak Derg 2003, 14 (2):102-106 Ekici ve Alişarlı
anottan katoda doğru azalan bir pH gradienti oluşur (15,
29). Numune tatbik edilip yürütüldüğünde protein
izoelektrik pH’sına geldiği anda net olarak yüksüzleşir.
Hareket etmez ve o noktada odaklanır (1, 15, 29, 30, 44).
Elektroforezde kullanılan jel boyama teknikleri
Elektroforez işleminden sonra jelin analizi için
boyama veya otoradyografi gibi yöntemlerden birisi tercih
edilir. En çok kullanılan analitik yöntem Coomasie
Brillant Blue R-250 veya gümüş nitrat ile boyamadır.
Coomasie Brillant Blue R-250 sadece 1.0-0.5 mg protein
miktarına kadar gümüş nitrat ise 10 ng protein miktarına
kadar duyarlıdır. Eğer proteinler önceden bir radyoaktif
izotop ile işaretlenmişse jelin analizi otoradyografi ile
gerçekleştirilir. Otoradyografi radyasyon yardımı ile bir
radyografik film üzerinde iki veya üç boyutlu görüntü
oluşturmaktadır. Görüntü çıplak gözle görülebilir. Ancak
önceden bir radyoaktif izotop ile işaretlemeyi gerektirdiği
için oldukça pahalıdır (9, 40).
Elektroforezin gıda analizlerinde uygulamaları
Gıda proteinlerinin tayininde elektroforez tekniği
çok geniş uygulama bulmaktadır. Buğday ve buğday
ürünlerindeki protein fraksiyonları elektroforez tekniği ile
ayrılabilmektedir. Elektroforez süt proteinlerinin
ayırımında da kullanılmaktadır. Sütün başlıca proteini
olan kazein elektroforezden önce pH 4.6’da asetik asit ile
çöktürülerek fraksiyonlarına ayrılmaktadır. Laktalbumin
α, β ve γ laktoglobulinler olarak ayrılabilmektedir.
Yoğurda hile amacıyla katılan jelatin proteinleri süt
proteinlerinden gayet iyi ayırt edilebilmektedir. Bu metot
ile yoğurda % 0.05 oranında katılan jelatin
belirlenebilmektedir. Yine yumurta akı içerisinde bulunan
yumurta proteinleri de karakteristik elektroforez bantları
ile belirlenebilmektedir.
Elektroforez hile amacıyla yapılan karışımların
belirlenmesinde etkili bir yoldur. İnsan sütünün inek sütü
ile karışımı, koyun ve inek sütlerinden yapılmış çeşitli
peynirlerin belirlenmesinde elektroforez kullanılmaktadır.
Elektroforez, proteinlerin ve enzimlerin saflığının
kontrolünde, oligo nükleotitlerin analizinde, proteinlerin
moleküler ağırlıklarının tespitinde, proteinlerin izoelektrik
pH’larının belirlenmesinde ve enzimlerin preparatif
eldesinde de kullanılmaktadır (11).
Polyakrilamid jel izoelektrik fokuslama
(PAGIF) tekniğinin et türlerinin ayırımında
kullanılması
Elektroforetik tekniklerin numunelerdeki % 2-10
arasındaki yabancı et karışımlarını tespit edebilmesi,
dondurulmuş, çok küçük parçalara ayrılmış, kürlenmiş, 75
°C’ye kadar ısıl işlemi görmüş ürünlerde uygulanabilmesi
ve genetik olarak birbirine yakın hayvan türlerinin
etlerinin ayırt edebilmesi gibi avantajları bulunmaktadır
(6, 14). Elektroforetik metotlardan PAGIF izoelektrik
fokuslama tekniği etlerin hangi hayvana ait olduğunun
belirlenmesinde kullanılmaktadır. Elektroforezde, etlerin
yapılarındaki türlere özgü iyonize gruplar taşıyan yüklü
kas proteinlerinin belli bir pH derecesine sahip elektriksel
alandaki hareket yeteneklerine göre etler ayırt
edilmektedir. İzoelektrik fokuslama metodunun prensibi
elektroforez metodunun prensibi ile aynı olup burada jelin
pH aralığı geniş tutulmuştur. Proteinlerin farklı pH
derecesine sahip taşıyıcı ampholitte izoelektrik
noktalarına göre elektroforetik ayrılmalarına dayanır.
Yabancı etlerin teşhisinde elektroforetik metotlardan
izoelektrik fokuslamayı, et orijinlerinin belirlenmesinde
ilk defa 1976 yılında Timbergen ve Olsman kullanmıştır
(39). Daha sonra diğer araştırıcılar, et türlerinin
belirlenmesinde izoelektrik fokuslama metodunu
kullanmışlardır (14, 20). PAGIF tekniği ayrıca balık
türlerinin belirlenmesinde de kullanılabilmektedir (20).
Fakat elektroforetik tekniklerin kullanımında laboratuarda
bütün hayvan türlerine ait referans protein veya enzim
bulundurulması zorunluluğu gibi zorlukları vardır (31).
Bununla birlikte yine elektroforetik tekniklerin yerleşik
kurulu bir laboratuara ve sistemin korunması için özel
bakıma ihtiyaç duyulması, testi yapanların teknik düzeyde
uzman olması, masraflı oluşu gibi zorlukları da
bulunmaktadır (26).
King ve ark. (24), düşük oranda çiğ sığır etine
karıştırılmış diğer et türlerini ayırmak için izoelektrik
fokuslama yöntemini kullanmış ve fosfoglukonat
dehidrogenase enzimini özel boyayarak et türlerini
birbirinden ayırmışlardır. King (23), PAGIF yöntemiyle,
pişmiş etlerde özel enzim boyamasıyla et türlerini
identifiye etmiş ve bu amaçla sığır, koyun, keçi, kedi,
köpek ve tavşan türlerini kullanmıştır. Decker ve ark. (5),
PAGIF yöntemini kullanarak domuz, koyun, keçi ve
geyik etlerini birbirinden ayırmışlardır. Gissel (10),
polyakrilamid jel izoelektrik fokuslama tekniği ile
bilinmeyen etlerden hayvan orijinlerini belirlemeye
çalışmış bunun için pH’ları 5.5 ile 8.5 arasında değişen
hazır poliakrilamid jeller kullanmıştır. Rehbein (34),
ultrathin-layer izoelektrik fokuslama yöntemiyle çiğ ve
pişmiş balık türlerini birbirinden ayırdığını bildirmiştir.
Bauer ve Hoffman (3), PAGIF yöntemiyle
kaslarda bulunan peroksidaz enzimini kullanarak domuz
ve tavuk gibi az myoglobin içeren türleri birbirinden
ayırmışlardır. Bauer ve Hoffman (4), PAGIF yöntemini
kullanarak ısı işlemi görmüş et ve et ürünlerinden hayvan
etlerinin türlerini birbirinden ayırmışlardır.
PAGİF tekniği; etlerin hangi tür hayvana ait
olduğunu veya et karışımlarında hangi türün yaklaşık ne
oranda bulunduğunu tespitte, güvenilir bir şekilde
kullanılabilecek bir metot olduğu anlaşılmaktadır. Ancak
bu teknikle elden edilen elektroferogramlar değişik
faktörler tarafından etkilendiğinden, bunların yorumlanıp
değerlendirilmesinde büyük özen gerekmektedir.
Gerek dünya ve gerekse ülkemiz için et ve et
ürünlerini oluşturan türlerin, bunların karışımlarındaki tür
çeşitleri ve oranlarının belirlenmesi, halen güncelliğini
koruyan önemli bir sorundur. Hile amacıyla ucuz etlerin
pahalı etler içerisine karıştırma oranın genelde % 20
civarında olduğu tahmin edilmektedir. Düşük kaliteli
etlerin, kaliteli etlermiş gibi etiketlenip satılması fazla kar
yapmayı amaçlayan kişiler tarafından yapılmaktadır. Hile
yoluyla daha fazla kazanç elde etmek için, karıştırma
104
Ekici ve Alişarlı YYÜ Vet Fak Derg 2003, 14 (2):102-106
oranının olabildiğince yüksek tutulmasına çalışılmaktadır.
Bu düşünceden hareketle, % 20 ve bunun üzerindeki
karışımlar hile bakımından ekonomik olarak kabul
edilmektedir(21).
İmmunolojik metotlar, yakın tür hayvan etlerinin
ayrımında cross reaksiyonların oluşması, ısıl işlem
görmüş et ve et ürünleri ayırımında kesin sonuç
vermemesi gibi nedenlerle pratikte güvenli bir şekilde
kullanılamamaktadır.
Ülkemizde gıda kontrol laboratuarlarında PAGIF
tekniğinin et ve et ürünlerinde bulunabilecek et türlerinin
belirlenmesinde rutin kontrol metodu olarak
kullanılabilmesi mümkündür. Gerekli yasal
düzenlemelerin yapılarak, bu amaçla kurulacak
laboratuarlarda PAGIF metodunun da belirtilen gaye için
kullanımı temin edilebilir. Ayrıca immunolojik metotların
rutin laboratuarlarda uygulanmasının zorlukları nedeniyle,
rutin laboratuarlarda PAGIF’in uygulanabilmesi için, bir
an önce her tür hayvan etine uygun standart ekstraktlar
üretilip ilgililerin hizmetine sunulmalıdır. Yine bu iş için
gerekli teknik bilgiye sahip personel yetiştirilmelidir.
İstanbul.